失礼します。遺伝子工学での質問です。

質問

失礼します。遺伝子工学での質問です。

私は現在大学院1年生で、今までタンパク質の実験を行っており、自力で遺伝子工学を行うのは初めてです。

大腸菌XL1のコンピテントセルを用いてプラスミドベクターの導入を行い、プレートにコンラージしました。ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子が入っており、LB培地にアンピシリンを加えて選抜しました。

培養後、LB培地にはコロニーがまばらに生えており、ベクターが導入されたと思われたので、コロニーをピックアップしてアンピシリンを加えたLB液体培地に植菌して培養し、プラスミドを回収→アガロース電気泳動によるベクター導入の確認を行おうと思っていました。

ベクターが確認され次第、少量残した液体培地の大腸菌をプレートに撒こうと思っていました。しかし、先輩に聞いてみると、

１、形質転換体のコロニーは培地からピックアップして、一度LB培地でストリークしてから液体培地に植菌しないといけない

２、液体培地に植菌した物をプレートの培地に植菌してはいけない

と言われました。１で、ストリークはベクターが確認出来た菌株を保存の為増殖させておくのだと思い、理解出来たのですが、２を行ってはいけない理由がイマイチ分かりません。

「そういう物なんだ」というのは少し疑問が残るので、ご存知の方がいらっしゃいましたらぜひ教えて頂けないでしょうか？

よろしくお願い致します。

回答No.1

negigi · ベストアンサー

先輩に聞いたほうが早いと思いますが・・・

少量であれば、撒いてダメってことはないと思ますよ。やったことないので、自信はないですけど。
おそらく、液体培地中のβラクタマーゼがプレート上に広がるのを嫌ってでしょうが、正確な理由はあなたの先輩に確認してください。

安全策をとるなら、液体培地をチップの先端でチョンとつついて（吸ってはいけません。つつくだけです）、プレートに数回引っ掻けばよいです。1回だけですとシングルコロニーが得られないと思うので、数回引っ掻いてください。
シングルコロニーをもう一回ミニプレップしてチェックする必要はあります。その際は、きちんとマスタープレートを作って、コロニーを保存しておくようにしてください。

お礼

ご返答ありがとうございます。

先輩に聞いてみたら、同じ事を言っていました。
例えば一度遠心して大腸菌のペレットに新しい液体培地に溶解させる手もありそうですね。

最初にストリークする理由もマスタープレートの作成であって、只の保存用って訳では無いんですね。

ありがとうございます。

回答No.2

overthisgraysky

２は、一度やってみればはっきりすると思いますが、大腸菌の数が多すぎてシングルコロニーにならないからでしょう。
理論上はみんな同一の遺伝情報を持っているはずなんですが、途中で変異を起こした奴が混じってしまうとややこしいのでシングルコロニーが好まれるようです。

うちでは、ミニプレップに移る前に、ピックアップしたコロニーをピペットチップで別のLB培地にコピーして、そのチップをそのまま液体培地に付けて培養します。
あとで大量培養するときはそのコピーしたコロニーを植菌します。
このコピーしたコロニーもすでにシングルコロニーとは言えないので、この方法が許されるかどうかは研究室によると思います。

お礼

研究室によって大分手法が違うんですね…。

先輩は滅菌した爪楊枝をコロニーに付けてそのまま培地にくっつけていました。

形質転換で選抜された菌は個体によってプラスミドの導入数も変化してしまう可能性もありうるんですね…。