TRIZOLによるRNA抽出

質問

TRIZOLによるRNA抽出を行っていますが、純度を良くするため、クロロホルムを加えて遠心した後の水層に、再度TRIZOLを200ul加えて混合、さらにクロロホルムを200ul加えて遠心を行ったところ、水層がほんのりピンク色になってしまいました。

水層にTRIZOLが混入しているのでしょうか？
原因と対策を教えてください。

回答No.2

f7d84xh · ベストアンサー

No.1の回答者ですが、追加の質問にお答えしたいと思います。

結論を述べると、CIAの方が望ましいがクロロフォルムでも問題ない、です。

CIAに入っているイソアミルアルコールはクロロフォルムを水と親和しやすくするために入れられています。

というのも、水とクロロフォルムは「水と油」でして（語弊あり）、チューブの中で二層に分離しますが、量比やチューブの内径によっては水が（水に浮かぶ油滴のように）滴となってチップで回収しにくくなってしまいます。

これを緩和するため、イソアミルアルコールを添加して適度な親水性を与えたものがCIAなのです。

CIAでも水層が残り少なくなると滴状になって回収が難しくなりますが、クロロフォルムだとそれがひどくなるといことです。

RNA抽出ですと中間層を避けてできるだけたくさんの水層を回収したいところですね。

器用さに自身のないかぎりはCIAの使用をおすすめします。

お礼

丁寧なご説明をありがとうございました。
手元にクロロホルムしか無かった為、それで試しましたが、ピンク色は無くなりませんでした。
原因が良く分かりませんでしたが、CIAでもう一度試してみようと思います。
ありがとうございました。

回答No.1

f7d84xh

TRIZOLのピンク色はただの着色料ですが、試薬中のフェノールが水層に多く溶けている可能性があります。

このフェノールが最終的に抽出したRNAを用いた酵素反応を阻害する恐れがあるので、その薄いピンク色の水層を回収後、等量～2/3倍量くらいのCIAで再度抽出することをおすすめします。

私はTRIZOLの標準的なプロトコールでもこの操作を行なっていました。

お礼

早々のご回答をありがとうございました。

基本的な質問になるのですが、CIAでの抽出はクロロホルムのみでも代用できますか？それともやはりCIAの方が良いでしょうか？

宜しくお願い致します。