His融合蛋白の精製

質問

関連トピをいくつか読み試してみましたが改善されませんでしたので新しく質問させていただきます。

1kbほどの遺伝子をpET32ベクターに組み込み、His融合蛋白として発現させました。
可溶性に発現していることは抗His抗体を用いたウェスタンブロッティングで確認しています。

カラムを用いて精製しようとしているのですが、融合たんぱくが全くカラムに吸着しない状態です。

バッファーの組成、pH確認及び調製の再確認
結合バッファーのイミダゾールの除去
を行いましたが改善されず、

4M尿素（カラムの許容範囲）を添加してみても改善されず・・

使用しているカラムはニッケルが添加済みのものです（アマシャムとインビトロジェンのものを試しました）

HisはN末についているのですがC末に付け替える以外には改善策はないのでしょうか？

回答No.5

lamb1204

連続投稿すみません。
ひとつ訂正があります。

以前、
>加えるトータルのタンパク質を5-10mg/ml resinにして上手く回収できています。
と書きましたが、正しくは、その半分程度の2.5-3mg/ml resinでした。記憶違いでした。もし試されてたら申し訳ないことをしました。
訂正して、お詫びいたします。

回答No.4

lamb1204

>ひとつお聞きしたいのですが、サンプルのｐH調製に用いる試薬は塩酸等の強酸や強塩基は避けているのですが、何を用いるのが一番ベストでしょうか。

TALONをお使いで、添付のプロトコルにしたがっておられるのなら、E/W buffer, Elution buffer 共に塩としてNaClが入っていますね？この場合は、塩基性側に調製するならNaOH、酸性側に調製するならHClを用いるのが適当です。（この場合に限らず、緩衝液のpHを調整する場合は、緩衝液中に含まれる塩を構成するイオンを用いるのがセオリーです。）特に、Elution bufferの方は、イミダゾールによってpHがずいぶん高くなっていますから、HClでpH7.0に合わせています。

それから、今思いつきましたが、レジンとタンパク質を混和・結合するときのトータルタンパク質の濃度が高すぎても収率がおちることがあったような気がします。私は、今は大体1-2 mg/ml位で結合させています。

回答No.3

lamb1204

追加でコメントさせていただきます。

可溶性に発現しているというのは、個人的には極めてうらやましい限りなのですが、組換えタンパク質は分子機能解析には使われないのでしょうか？抗体作製のために精製されているのでしたらいいですけれども、機能を追われる場合は、折角可溶性に取れているのですから、Hisタグに執着せずに、他の方法で精製されたらいかがでしょうか？ゲルろ過、イオン交換くらいを通せば割ときれいになるはずです。硫安沈殿も活性を失わずに精製と濃縮を行なうのには有効な場合が多々あるでしょう。どのフラクションに入ったかは、抗Hisタグ抗体が特異的なことを確認されているのなら、ウェスタンまでしなくてもドットブロットでも充分かもしれません。

あと、変性して精製を試みているということは、フォールディングによってHisタグが露出していないためということでしょうか？その観点で言いますと、S-Sの還元も行なったほうがいいかもしれません。還元剤は、カラムに入れる前に透析などで抜かなくてはいけなくなりますが。

それから、たぶん余計なお世話ですがpHは、全部混ぜた後にあわせていますよね？

お礼

お礼が遅くなってしまって申し訳ありません。
C末につけかえて作製しなおしておりました。
こちらでも全く改善がみられず・・

組み換えたんぱく質を作製している目的は、抗体作製とELISAの抗原として使うためです。ですのでどうしても精製する必要があるのです。

変性条件で精製しようとしているのはおっしゃるとおりHisタグが隠れている可能性を考えてのことです。

ｐHですが全部混ぜた状態（カラムに入れる直前の状態）で測定しています。結合バッファー・溶出バッファー・サンプルを測定しています。

ひとつお聞きしたいのですが、サンプルのｐH調製に用いる試薬は塩酸等の強酸や強塩基は避けているのですが、何を用いるのが一番ベストでしょうか。

回答No.2

lamb1204

関連トピに何が書かれていたのか解らないので重複するかもしれません。
それにもっと数字が無いとなんとも言いがたいですが、一応、私の経験から。

　私がHisタグ精製をしていて、あまりに収率が低いときは、タンパク質試料と担体の量比を検討することでかなり改善されました。要は、メーカーのいうタンパク質結合キャパシティーをあまり信じ過ぎないほうがいいかもしれません。
　私の場合は、不溶化したタンパク質を8M Urea変性下で、TALON（NiではなくCoです）を使って精製しています。TALONは公称5-10mg/ml resinのキャパですが、実際には、加えるトータルのタンパク質を5-10mg/ml resinにして上手く回収できています。
　それから、結合反応時間も同様に自分で検討してみたほうがいいと思います。オープンカラムでしたら、バッチで緩やかに混和し、１時間ぐらいまでは検討してみるべきです。プレパックでしたら、結合時の流速は0.5 ml/mlかもっと遅いくらいでもいいかもしれません。

お礼

ご回答有難うございまた。
こちらに書き込んでからTALONも用いて行ったのですが
やはりまったく結合はみられませんでした。
オープンカラムを用いて結合時間は15分、30分、60分とふっています。
変性剤も尿素（４M)、グアニジン（６M)と2通り試しましたが全くダメでした。

トータルタンパク量については全く検討しておりませんでしたので
変性剤の濃度を上げることと２点につきまして検討してみようと思います。

回答No.1

Dr_Hyper

確認させてください。まったくカラムに吸着していないというのはフロースルーをwesternで確認したということでよかったですか？
もし差し支えなければ定量的な情報をもう少しください。
His-tagのついた他のタンパク質で試したことはあるのですか？
質問ばかりで申し訳ないですが、何かコメントできれば良いのですが。

補足

回答有難うございます。

Hisタグ融合蛋白の精製を行うのは今回が初めてです。

可溶化上清をSDS→ウェスタンで目的サイズのたんぱく質が可溶化上清に来ていることを確認。

カラムのフロースルーをSDSーPAGEしたところ、上記と同サイズのタンパクが確認できました。このバンドの濃さがカラムにかける前の検体の濃さ（pH調整後のもの）と同じであること。
また、カラムから溶出したものに全く上記のタンパクが確認できなかった（SDS-PAGE)ことからカラムに吸着していないと判断しました。

情報不足で申し訳ありませんでした。