大腸菌ベクターのタンパク質生産について

質問

私は今大学生なのですが、遺伝子工学でヒトのあるタンパク質遺伝子を発現ベクターに組み込んで大腸菌で発現させようとしているのですが、可溶性の画分に目的のタンパク質が得られなかった場合に考えられる原因と解決策を知りたいのですが何があるでしょうか？
自分なりに考えてみたものとしては、１、細胞毒性を示すタンパク質のため。２、コドンの使用頻度の違い。３、タンパク質の不溶化。４、翻訳後修飾が行われない。等があると思うのですが、これらの解決策としては何があるでしょうか？
不溶化については尿素で可溶化したり、分子シャペロンを用いたりする方法があるかと考えましたが、他の要因に対する解決策があまり思い浮かびません。
どなたか分かる方がいらっしゃいましたらご指導の程よろしくお願いいたします。

回答No.2

sfwaesr

こんにちは。
様々な要因が考えられますが、大きくまとめると次のようになります。

１．材料が悪い（プラスミドのフレームがずれている。ベクターに含まれるタグの部位に変異が入ってしまっている。大腸菌が悪い）
２．発現させるタンパク質に起因する問題（質問の中に並べられたことがメインだと思います）

原因２について、問題の絞り込みをされたら良いかと思います。
IPTGなどで発現誘導しているかと思いますが、まず、溶解した抽出液をそのまま（遠心をかけずに）、ウェスタンブロッティングをしてみると問題が整理されます。その際、多量に含まれるDNAがサンプルのアプライ時にじゃま（粘性が高く、ピペットマンで溶液を吸えない）になると思います。そこで、抽出液に2XSDS sample bufferを加えて、95℃で５分（私はこのばあいは15分と長めにしています）ボイルした後に、トップスピードで15分間遠心してみてください。その上清をウェスタンブロッティングに回します。

それでタンパク質が検出されれば、不溶性画分への移行（Ureaや市販の不溶性画分からの精製キットなどを使った回収）や精製の失敗（精製や洗浄の条件の至適化が必要）が考えられます。

タンパク質が検出されないときは、細胞毒性のために、目的のタンパク質を発現している菌体が死んでいるかどうか判定します。多くの場合は、菌体の増殖で判断できます。毒性が故に菌体が死んでいるときは、O/Nでカルチャーしてもconfluentになっていない様な印象になります。

もし、普通に増えているのであれば、タグが切れている可能性もあります。GST融合タンパク質であれば、anti-GST Abでウェスタンしてみてください。25~30kDaに強いバンドが見えるときは切れています（意外とこのケースをよく体験します）。そのときは、MCSを変えてみる（GSTと目的のタンパク質の間のリンカー部分が原因に成ることがあるため）と改善することがありますし、培養条件を変える（誘導後22℃でO/Nカルチャーなど）のも解決策になることがあります。

これでも、原因が定まらないときは、原因１も含めて複雑な理由が考えられるので、思い切って「菌体」と「ベクター」を変えられることをお勧めします。

これは一般論ですが、比較的大きなタンパク質は大腸菌は嫌います。もちろん、150kDaのタンパク質も普通に発現することもあれば、20kDaでも発現しないこともあります。

もし、大腸菌で発現がうまくいかないけど、どうしてもタンパク質が欲しいときはバキュロウィルスのシステムか、哺乳類細胞の系に変えるのも手だと思います。特に最近はInvitrogen社のFlp-In T-Rexはドキシサイクリンで発現誘導できる安定株がトランスフェクションから２週間後には樹立されクローニングがいらないこと、293細胞がベースのため増殖がそこそこ早いこと（トランスフェクション後、約１～２ヶ月で150mmディッシュ１００枚以上になります）から、私は１ヶ月程度待てるときは哺乳類細胞でタンパク質を作っています。

使われた菌体と発現させるタンパク質のサイズや特別な性質（pIがどちらかに偏っているとか疎水性が高い）、タンパク質の検出方法などについて教えていただければ、もう少しコメントできるかもしれません。

頑張ってください！

お礼

質問者のchelsea22です。
とても丁寧な回答ありがとうございました。
一度色々と試してみます。

回答No.1

otx

羊土社などの実験書を見てみてください。
沢山、改善されるかも？という条件が示してあります。

この手の質問はこれぞという特効薬的な策はありません。
タンパク質を扱うものの永遠のテーマであると思います。

お礼

質問者のchelsea22です。
一度探してみます。ありがとうございました。