大腸菌の超音波破砕について

質問

大腸菌でタンパクを発現させ、超音波破砕をし、遠心して上清を回収することで、目的のタンパク質を回収する方法があります。目的のタンパクは、GSTなどの可溶性の高いタンパクを結合させることによりペリプラズム間に移行させます。
　ここで大腸菌の壊れている状態について確認させて下さい。
(1)超音波破砕をすると菌体も壊れるのですよね？
(2)ペリプラズムだけを壊すのには、透圧ショックが適切ですよね？
(3)超音波破砕した後、遠心した上清を回収したことは、ペリプラズム＆菌体内全部における可溶性の高いタンパクの回収したことになるのでしょうか？
　また、上記の遠心後のペレットの方も上清画分と同様に、SDS-PAGEを行いました。ペレットにはかなり様々なバンドが濃く見えました。
(4)SDS-PAGEをすると菌体は全体が壊れると思いますが、これはSDS-PAGEにおいて泳動する前に、サンプルにSDSを入れてboilする過程において菌体が破裂するのですよね？
(5)界面活性剤（SDS）を加えただけでは、菌体は破壊できませんよね？(6)界面活性剤でペリプラズムのみ壊せているのでしょうか？
　長くなりすみません。菌体が全部壊れているのか、ペリプラズムだけ壊れているのかよく分からなくなってしまったのです。
(7)最後に、凍結粉砕という方法もありますが、こちらも菌体全部壊れますよね？
大変こんがらがってしまいました。どなたか、よろしくお願いします。

回答No.1

otx · ベストアンサー

（１）そうだと思います。何でもかんでも壊していることになると思います。

（２）大腸菌を浸透圧ショックで壊す方法を、私は今まで見たことがありません。っていうか、真水でも浸透圧で壊れないのでは？

（３）そうだと思います。そもそも、（１）でもそうですが、超音波では、大腸菌の何をどこまで壊すという微妙な操作は難しすぎると思います。

（４）いいえ。そもそも室温のSDS溶液でも溶けます（低温すぎて析出している場合はだめな気がしますが）。ボイルは完全に溶かす念のためです。

（５）いいえ。壊れます。

（６）いいえ。おそらく全部壊れていると思います。
大腸菌からプラスミドを抽出したことはありますか？それならばわかると思いますが、
プラスミドを抽出するときに大腸菌を壊す作業があるのですが、
用いる溶液にはSDSが入っています。
このとき、ボイルしなくても溶けてしまいます。

お礼

お礼が遅くなりすみません。ご丁寧にありがとうございました。大変参考になりました。

回答No.2

otx

あ、（７）目的は菌体全部壊すためだと思いますが、効率が良い方法ではないと思いますので、完全に壊れないとは思います。
この方法では、大腸菌のある部分だけを壊すという操作は出来ないと思います。

お礼

お礼が遅くなりすみません。参考になりました。ありがとうございました。