大腸菌でタンパク質の発現

質問

大腸菌でタンパク質の発現させたのですが、すべて不溶性画分に発現していて、リコンビナント酵素を得ることが出来ません。これまでIPTG濃度、培養時間、コンピテントセル、ベクター等検討しましたが、だめでした。どうしたら発現しますか？pET3aで発現しなかったため、今ベクターはpColdベクターです。

回答No.3

pen82 · ベストアンサー

pColdを使用しているということは、培養は低温なのですね。

破砕バッファーは、いろいろ試されたのでしょうか？
バッファーのpHや、含まれる塩の濃度によってタンパク質が沈殿したり溶けたりすることがあります。

塩濃度は、一般には50～300mMのことが多いですが、0mMのときだけ可溶化するものや、反対に、１Mくらいの塩が入ってないと沈殿のものもあります。

どの条件で試すのが一番良いのかは、わかりませんが、ある程度培養条件を変えてもだめな場合は、菌の破砕条件を変えるのも一つの方法です。

お礼

ありがとうございます。バッファーをいくつか検討してみましたが、不溶性に発現していました。少しでも発現してくれたらいいんですけど・・・難しいですね。いろいろ試してみます。

回答No.2

Kohntarkosz

誘導後の培養温度を下げると効果的である場合があります。
また、可溶性タンパク質との融合タンパクとして発現させるとうまくいきやすいようです。

回答No.1

alice_with_tak

不溶性画分となることはよくあります。Lysis Bufferに尿素などを加えて可溶化することができます。尿素の濃度によってはタンパクが失活することもあるのでいくつか濃度を試してください。上限は6Mぐらいです。