大腸菌での組換え蛋白質の発現

質問

分子量約100kの蛋白質をHis-tagとの融合タンパク質として
大腸菌に作らせていますが、封入体に入ってしまっているようです。
ブロットオーバーレイ（ウエストウエスタン）のプローブとして使いたいと思っています。
機能不明なので、高次構造が大事かどうかも不明ですが、
ちゃんとしてるにこした事はないと思っています。
こうゆう場合、本などを見ると、

低温で培養してみる
GST等とのfusionに変えてみる
ドメインごとに発現させる

等のことが書いてありますが、下２つは結構大変ですよね。
以上のような可溶化条件の検討に努力を費やしたほうが良いのか
それとも、尿素やグアニジン塩酸のようなもので
強引に可溶化して、リフォールディングに努力を費やした方が良いのか
教えてください。

回答No.1

nao0_0nao · ベストアンサー

大腸菌での発現はやってみないとわからない....
というのがホントのところだと思います。
お手軽でいいんですけどねぇ。。。

以下は回答ではなく私だったら....
という提案ですので参考までに。

分子量が100kということですので、フルで発現させると
可溶性画分で回収するのは難しいのではないかと感じます。
なので、尿素やグアニジン塩酸で可溶化して、
リフォールディングを行ないつつ、
低温での培養やドメインごとの発現を同時進行します。

もしかしたら、大腸菌以外の発現系だと
あっさりといくのかもしれませんね（笑）。

お礼

ありがとうございます。
やはり可溶性画分に回収するのは難しいですか。

回答No.2

M_Biologist

100kDaを超えるタンパク質を大腸菌で作らせるのは大変ですよね。

僕ならば、
１．温度やIPTGの濃度を下げて、タンパク質合成の速度を落とす。
２．マイルドなプロモーターを使う。（pBADなど）
３．セルフリーの系を用いる。
PROTEIOS（Toyobo http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/product/proteios/proteios.html)
RTS (Roche http://www.roche-applied-science.com/rts/)
Expressway (Invitrogen http://www.invitrogen.co.jp/jp_prdct/molecular_biology/k9600001.htm)

などを考えます。

お礼

回答ありがとうございます。
やはり大腸菌では難しいのかな。