GST融合タンパク質発現ベクターpGEX6Pについて

質問

初めて質問いたします。
現在GST融合タンパク質を発現、精製するために、
pGEX6P-1(GEヘルスケア)というベクターを用いております。
培養条件は37度でOD0.5まで培養し、
IPTG 0.05mMまで添加後、
20度でovernight、培養しております(ホストはBL21でDE3ではないです)。
その後グルタチオンカラムで精製すると、
なぜか目的のタンパク質のほかにGSTそのものも発現しております。
他の目的タンパク質を導入した際にもこういったことがおきております。
こういったことは一般的なのでしょうか？
かなりGSTが発現してしまっているので、
カラムで精製したときに目的タンパク質の収率が非常に悪くなっているように思います。
アドバイスいただけますと助かります。
よろしくお願いいたします。

回答No.1

miya_0726 · ベストアンサー

融合タンパク質発現用のプラスミドを作った際に、single colony isolationが不十分だったのではないでしょうか？
その株からプラスミド取って1カットの制限酵素で切断したらバンド2本見えませんか？

補足

回答ありがとうございます。
電気泳動からもシングルコロニーが得られていると思っております。
しかも異なる3クローン作って全てこのような現象が起きているので。。。
一般的な話ではないですかね？？

回答No.4

nativepage

なるほど、目的タンパク質はインクルージョンボディでGSTは可溶性というのはよくある話ですね。別にベクターのせいではないです。

インクルージョンボディを溶解してリフォールドするか、目的タンパク質の全長が必要ないのであれば、どちらかの末端を削って可溶性画分にこないか試すといったところでしょうか。

また、わずかでも可溶性な全長タンパク質が取れているのであれば、リットル単位で培養ののち、目的タンパクとGSTを適当な方法で分離、精製という力業が意外と解決の近道だったりします。

補足

やっぱり一般的にあるんですか？？？
GSTそのものが発現(分解産物？)しちゃうケースって。
リフォールディングって個人的にあんまり信じてなくて。。。
やっぱり、ファーメンターで10L培養ですかね。

回答No.3

nativepage

目的タンパク質のアミノ酸配列によっては、途中で翻訳が停止しやすかったり部分分解しやすかったりするので、そのせいかもしれません。

目的タンパク質も発現しているのならば、一度ゲルろ過などで目的タンパクとGSTを分離してしまうのも手です。

補足

そうですね。。。
その手は考えておりました。
ただインサートの異なるものでも、
同様な現象が起きているので、
ベクターの仕様なのかなぁとも思っているところです。
(シーケンスからコンストラクトは問題ないと思っているので。)
ゲルろ過、アフィニティ、消化、ゲルろ過(and, or)イオン交換がよさそうですよね。
インクルージョンボディも結構多くて、
収量があまり期待できないってのも難点です。
結構はまってますよね。。

回答No.2

miya_0726

ANo.1です。

とすると、融合部分が微妙に異なるクローンが混ざっている可能性は考えられませんか？
融合部分周辺のシーケンスは実施されましたか？

補足

形質転換後、必ずシングルコロニーを複数個拾って制限酵素消化による確認を行い、シーケンスを読んであたりをみつけているのですが。。。もちろん融合部も確認しております。