※ ChatGPTを利用し、要約された質問です(原文:Hisタグをつけたタンパクの精製および濃縮について)
Hisタグをつけたタンパクの精製および濃縮について
このQ&Aのポイント
Hisタグを使用したタンパクの精製および濃縮についての質問です。
質問内容は、カラム操作中に蛋白が流れてしまう現象と、AmiconでのBuffer置換および濃縮で蛋白がロスする原因と解決策についてです。
蛋白の発現量は良く、銀染色・WesternBlottingで確認済みですが、Amiconの操作で蛋白のロスが発生しています。糖鎖の多いタンパクの場合も同様の現象が起きた経験があります。
Hisタグをつけたタンパクの精製および濃縮について
もしわかる方がいらっしゃいましたらご教示ください。
私はII型膜蛋白(C末端にHis-Mycタグ有)を動物細胞にて発現させ、Niカラムで精製後、Amicon(MILLIPORE製)を使用して蛋白のBuffer置換および濃縮を行っています。
お聞きしたいのは以下の2点です。
1.カラム操作でWashに使用する0.01%Tween-PBSで蛋白が流れてしまうようなのですが、このようなことってあるのでしょうか?
2.AmiconでBuffer置換および濃縮を行うと、Amicon内で析出しているのか、蛋白の大部分をロスするということがおきています。考えられる原因と、析出させずにBuffer置換(Imidazole→PBS)を行い、5倍程度に濃縮させる方法がありましたらお教えください。
発現量はかなりよく、WesternBlotting・銀染色で確認済みです。
また、精製後も銀染色・Westernで確認していますので、蛋白が存在していることは確かです。濃縮(5mL→1mL)後は蛋白量が1/10くらいになっています。
以前糖鎖の多いI型膜蛋白の発現精製を行った際にも同様にAmiconの操作で大部分をロスするということがありました。そのときは糖鎖が多いせいなのか…ということになりましたが、今回の蛋白は糖鎖が3つほどしかついていなく、特別多いというわけではありません。
同様の実験を行っている人にプロトコルを確認しましたが、やっている手技に間違いはないように思います。
同様の経験をお持ちの方、また知識のある方、いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。
お礼
回答いただき、ありがとうございます。 Amiconはいつも20分くらい一気に回していました。 20分遠心→PBSを追加&ピペッティングで攪拌→再び20分遠心と…。 なるほど、そこまで気を使っていませんでした。 透析でBufferを交換することは以前にも行ったことがあります。 いかんせん、濃度が薄いので量を減らさないと…ということでしたので、ここで相談させていただきました。 Eluteの量を減らすというのも1つの手ですね。 蛋白は確かにモノによるところが大きいです。 一概にコレとは言えないものなんですね。 いろいろ試行錯誤してみます。 ご教示いただき、ありがとうございました。