- 締切済み
カラムについての質問です
タンパク質初心者です。 とてもくだらない質問なのかもしれませんが、教えてください。 Hi Trap Q Hi Trap SP の違いは何ですか？ ２つを使い分けるとき、判断するポイントはどこですか？ 実際に精製を行うときに、どのように実験を組み立てていくのですか？ どのような精製を行うかによって違うと思いますが、たとえばHis-tag の場合、どの辺に注目して使用するカラムやbufferを決めているのか、 教えてください。 よろしくお願いします。
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
みんなの回答
- mmmma
- ベストアンサー率41% (683/1637)
関連するQ&A
- oligo dT カラム の再使用について 教えてください
total RNAからmRNAを精製しています。 それでアマシャム製のoligo dTカラムを使用しているのですが、 これはリユース可能なのでしょうか？ 可能だとしたら何回くらい大丈夫なもの なのか教えていただきたいと思います。 一度使った後には、high bufferを入れて保存 しておいています。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- Hisタグをつけたタンパクの精製および濃縮について
もしわかる方がいらっしゃいましたらご教示ください。 私はII型膜蛋白(C末端にHis-Mycタグ有)を動物細胞にて発現させ、Niカラムで精製後、Amicon(MILLIPORE製)を使用して蛋白のBuffer置換および濃縮を行っています。 お聞きしたいのは以下の2点です。 １．カラム操作でWashに使用する0.01%Tween-PBSで蛋白が流れてしまうようなのですが、このようなことってあるのでしょうか？ ２．AmiconでBuffer置換および濃縮を行うと、Amicon内で析出しているのか、蛋白の大部分をロスするということがおきています。考えられる原因と、析出させずにBuffer置換(Imidazole→PBS)を行い、5倍程度に濃縮させる方法がありましたらお教えください。 発現量はかなりよく、WesternBlotting・銀染色で確認済みです。 また、精製後も銀染色・Westernで確認していますので、蛋白が存在していることは確かです。濃縮(5mL→1mL)後は蛋白量が1/10くらいになっています。 以前糖鎖の多いI型膜蛋白の発現精製を行った際にも同様にAmiconの操作で大部分をロスするということがありました。そのときは糖鎖が多いせいなのか…ということになりましたが、今回の蛋白は糖鎖が3つほどしかついていなく、特別多いというわけではありません。 同様の実験を行っている人にプロトコルを確認しましたが、やっている手技に間違いはないように思います。 同様の経験をお持ちの方、また知識のある方、いらっしゃいましたらよろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質の保存期間
Hisタグつきタンパク質をNiキレートカラムで精製し、 イミダゾールで溶出したのですが、 そのまま4℃で保存する場合、イミダゾール溶液中ではタンパクはどれくらいの期間安定に保存できるものでしょうか？ タンパク精製に不慣れなため、ご回答よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパクの精製について質問があります。
タンパクの精製について質問があります。 GSTタグ融合タンパク質をG-sephaで精製しているのですが、樹脂から溶出されなくて困っています。 タグはThrombinで切り離して、Thrombin処理後にbufferで溶出しています。 bufferには100mM程度の塩が加えられているのですが、どうも樹脂に絡まって出てこないという状況 なので、思い切って500mM～1Mの範囲で、条件を検討してみようかと思っています。 塩濃度を上げすぎるとタンパクに良くない（変性する）などの問題が出てくるでしょうか。 また、1Mの塩が入っているbufferで溶出しても後に透析などで塩を除けば大丈夫なものなのでしょうか。 また、塩で溶出した場合、Thrombinで切断されずに残ったGST融合タンパクがタグ付きで出て来てしまう、切断はされたものの、GSTタグだけのものもG-sephaとの相互作用が弱くなって出てきてしまう、などのトラブルはありえますか。 素人なので良くわかりません。 どなたか経験者の方、ご教授よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ハイドロキシアパタイトについて
タンパク質の精製にハイドロキシアパタイトカラムを使用する場合、このクロマトグラフィーに用いるサンプル中に0.1% NP-40が含まれていても実験に影響は出ないでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- Hisタグを用いたタンパク精製
もし、分かる方がおりましたらアドバイスよろしくお願いいたします。 私は、枯草菌の研究をしています。 ある遺伝子の働きが「ラセマーゼ」ではないかということをin vivoの実験において確認しました。 しかし、in vivoにおいては十分に証明できなかったのでin vitroでタンパクを精製し、ラセマーゼ活性を測定しようと考えています。 pET15bにこの遺伝子を組み込みHisタグを付けてニッケルカラムで抽出しようとしているのですがうまくいきません。 何かわかることがありましたらアドバイスよろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 大腸菌からのHisタグタンパク質精製
大腸菌からHisタグ付タンパク質(100kDa)を精製しているのですが、発現はたくさんしているのですが、His精製すると、フロースルーにたくさん落ちてしまい、一部しか精製できません。フロースルーを別のレジンでもう1度精製するとさらにまたフロースルーに落ちてしまい、またしても1部しか精製できません。精製できている1部は、レジンの説明書に書かれている精製可能なタンパク質量から考えると10分の1量ぐらいしかとれていません。また一度目の精製ではバックが高く、フロースルーをもちいた二度面の精製ではそのバックはかなり消えています。1度目の精製ではものよりもバックのほうがより結合しやすくなっているのでしょうか？CBBでみた発現量では圧倒的にもののほうがおおいのですが・・・分子量が大きいタンパク質ではこのような現象がおこるのでしょうか？何かご存知の方がいらっしゃいましたらお教えください。
- 締切済み
- 生物学
- His融合蛋白の精製
関連トピをいくつか読み試してみましたが改善されませんでしたので新しく質問させていただきます。 1kbほどの遺伝子をpET32ベクターに組み込み、His融合蛋白として発現させました。 可溶性に発現していることは抗His抗体を用いたウェスタンブロッティングで確認しています。 カラムを用いて精製しようとしているのですが、融合たんぱくが全くカラムに吸着しない状態です。 バッファーの組成、pH確認及び調製の再確認 結合バッファーのイミダゾールの除去 を行いましたが改善されず、 4M尿素（カラムの許容範囲）を添加してみても改善されず・・ 使用しているカラムはニッケルが添加済みのものです（アマシャムとインビトロジェンのものを試しました） HisはN末についているのですがC末に付け替える以外には改善策はないのでしょうか？
- 締切済み
- 生物学
- 現在、GST融合タンパクを精製しているのですが、樹脂に吸着させた後、T
現在、GST融合タンパクを精製しているのですが、樹脂に吸着させた後、ThrombinでGSTを切り離してから溶出させています。 その際、SDS-PAGEで確認するとタグは切れているようなのですが、樹脂に絡まって溶出されてこないというトラブルに合っています。 このような問題の場合、一般にはどのような対処をされていますか。 私は、塩濃度を上げてみる、溶出bufferにTriton等を入れてみる、などを検討しているのですが…
- ベストアンサー
- 生物学
- 有機合成にお詳しい方お願いします！
大学院生です。有機合成を行っています。 お詳しい方お願い致します。 有機合成後の精製でさまざまな可能性を探っています。 私の生成物は、以下の特徴を持っています。 ・超分子錯体にペプチドをマレイミド/システインのマイケル付加を用いてラベル化したもの ・超分子錯体の分子量は3500、ペプチドの分子量は1500。生成物は5000です ・原系から全て水溶性です ・有機溶媒は使えません。超分子錯体が分解されるため、水（バッファー）しか使えません ・精製後は生体実験に用いるため、PBSに溶かして使います。出来れば精製後は脱塩済みの固体にできればベストです といったものですが、今のところGPCに頼っています。 ただ、カラムをLCに繋げて行い、カラムはタンパクの精製に使うようなものなので、 しっかり精製できるか微妙です。 分子量5000以下をカットする透析膜、適切は分画カラムを新たに買うことは高価であれば難しいです。 何か方法はないでしょうか？ お願い致します。
- ベストアンサー
- 化学
お礼
ありがとうございます。 教えていただいたサイトもとても参考になりました。