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PCRのスメア

こんにちは。 早速質問ですが、PCRを行っていますが産物を電気泳動しますとスメアになってしまい困っています。 テンプレートDNA量やアニーリングの時間を変えても同じです。スメアといっても、バンドが見えず高分子から低分子まで全体に広がっています。アニーリングの温度が原因かと思いアニーリングの温度を55℃から57℃に上げましたがだめでした。 酵素はABI社のTaq goldを使用しており、プライマーのTm値は57℃と60℃のものを使用しています。

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  • 回答No.2
  • Dr_Hyper
  • ベストアンサー率41% (2481/6028)

示されているTmが正しければ、非特異的なバンドが出ることはあってもそれほどひどいスメアになるような温度ではないとおもいます。 すでにbufferにMgが含まれているのに、さらにMgを入れすぎてはいませんか? アニーリングおよび伸長の時間が長すぎませんか? dNTPの濃度が高すぎませんか(入れすぎていないか?) この3点が原因になることが多いです。 初歩的なことですが、アガロースゲルには問題はないですね?マーカーがキレイに流れていれば問題ないです。

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その他の回答 (2)

  • 回答No.3

酵素を入れすぎていませんか?

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  • 回答No.1

色々な原因が考えられますが、単純にプライマーのTmが低いだけかと  60℃以上は欲しいですね(templateが長い場合は65℃以上とか)、というより大抵アニーリングはTm-5℃ぐらいでやると思うんですが その点は大丈夫でしょうか

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