cDNA濃度測定の重要性と測定方法の検討
- cDNAの濃度を測定することはリアルタイムPCRに進む前に重要です。
- 分光光度計を使用してcDNAの濃度を測定する方法について検討します。
- RT(-)のcDNAをblankとして使用する方法にも注意が必要です。
- ベストアンサー
cDNA濃度測定
「一定量のRNAをインプットして、cDNAを作製した後、リアルタイムPCRに進む前にcDNAの濃度は測定したほうがいいのでしょうか？http://oshiete1.goo.ne.jp/qa3220427.html」の質問と回答をみさせていただきました。 私もこの過程で悩んでいるのですが、もしｃDNAを分光光度計にて測定するとした場合のblankに関して教えていただきたく記載させていただきました。 ｃDNA作成時にゲノムDNAのコンタミチェック用にRT（-）のものも作成しています。そこには同量のランダムプライマーやdNTPが入っています。そのRT（-）=ｃDNA（-）をblankとして、他のｃDNAを分光光度計で測定するという方法は問題があるでしょうか？（ちなみにRT(ー)のものは電気泳動でみてバンドが出ないことを確認しています） 素人考えなので、教えていただければ幸いに存じます。 よろしくお願い致します。
- nkmt2009
- お礼率63% (7/11)
- 生物学
- 回答数1
- ありがとう数2
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
事情を理解しておりませんので意味の無い回答かも知れませんが、出来たcDNAに対してdNTPやoligo primer ゲノムのコンタミのが測定に影響するだけ十分に多いでしょうから単純に測定するのは意味を持たないでしょうね。複数種類のRNA samplesからそれぞれcDNAをつくったときのRT反応の効率を気にされているのでしょうか？このような評価はやはりGAPDH b-actin rRNAなどのハウスキーピングジーンを複数コントロールとして増幅し補正するのが一般的だと思います。TAKARAなどでprimerのセットが売り出されているので参考にされたらいいと思います。マイクロアレーに用いるようなサンプルの評価も結局はこのような複数のcontrolを用いての検定でしか意味のある評価は出来ないように思います。 もしこのような一般的な検定では不足がある理由が他にあればその旨補足してください。
関連するQ&A
- mRNAにおける遺伝子の発現について
遺伝子実験初心者です。 mRNAにおけるとある遺伝子の発現レベルを調べる実験を行おうとしています。 リアルタイムPCRを行える環境でないため、次のように実験を行おうと思っています。 RNAの抽出→RNA量の測定→RT-PCRでcDNAを作製→目的遺伝子のプライマー＆ハウスキーピング遺伝子のプライマーを用いてそれぞれPCRにて増幅→電気泳動にてバンドの濃さを確認。 Aの細胞集団(1×10の6乗個)から抽出したRNAと、Bの細胞集団(5×10の6乗個)から抽出したRNAにおける、とある遺伝子の発現を比較したいのですが、両細胞から抽出したRNAをAとBで同量になるようにして実験を行えば、正しい比較ができていると言えますか？
- ベストアンサー
- 生物学
- RT-PCRが上手くできないのですが
RT-PCRでポジコン(GAPDH)を含めたバンドが検出されません。 RNAはキットの製品を使用し、OD260/OD280で2程度、電気泳動でRNAを確認しました。（poly-Aに精製してません） cDNAの作成もキットで、Randam hexamer primerを使用しました。 PCRは論文に掲載されているprimerと条件で行いました。 cDNAが上手く出来ていないのかprimerがいけないと思うのですが、このような状態でどのような原因検索をしたらよいでしょうか？ また、primerはcDNAという1本鎖のDNAに対してでもsenseとanti-senseのペアーが必要なのはなぜでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- ＲＴ－ＰＣＲ
RT-PCRでcDNAの作成を行っています 通常は、 RNA抽出物を逆転写して (polyA primerで) PCRへもっていっています。 しかし 先日ふと思い立って、 RNA抽出物を鋳型として そのままPCRしてみました。 すると、このRNA抽出物を鋳型としてPCRした場合も、 ｃDNAを鋳型とした時と同じ位置にバンドが出てきました。 このバンドは、鋳型RNAをRNAse Aで処理すると消えます。 このPCR産物の シークエンスをチェックしてみると、 目的遺伝子であることが確認できました。 （全長800bpの中の500bpのシークエンスを確認) RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています。 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません。 この場合、 RNAを鋳型として 目的遺伝子が増幅しているのでしょうか？ あるいは、 ゲノムDNAがコンタミが原因で イントロンを含んだものが増えているのでしょうか？ 通常、 DNA polはRNAを鋳型として 遺伝子増幅できないといわれていますが、 本当でしょうか？ 何か参考になる文献があれば 教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- cDNAからのmiRNAの検出
はじめまして。 miRNAについては素人なもので、質問させてください。 今、miRNAに関する実験を始めようとしていて、組織や検体における目的のmiRNAの発現量をreal time RT-PCRで調べたいと考えています。 通常、よくやられている方法は、市販されているkitを用いてtotal RNAから逆転写したcDNAを用いていると思います。 そこで質問なのですが。Kit等ではなくて通常の方法で逆転写したcDNA（superscript、randum primer）からmiRNAを検出することは可能でしょうか？ それとも、やはりmiRNA用の逆転写を行う必要があるのでしょうか？ よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- RT-PCRについて
RT-PCRの質問です。 RNAからcDNAに逆転写するときに、Randam Primerと いうものがありますが、これってランダムにRNAに くっつくのですよね？だからいろんな長さのcDNAが できてしまうと思うのですが、Randam Primerを使っても 大丈夫でしょうか？Randam Primerの他に、オリゴdT Primer というのもありますが、どっちが逆転写に良いのでしょうか？ あと、cDNAを増幅させるときのPCRで、遺伝子特異的な プライマーを使おうと思うのですが、１つのサンプルに センスとアンチセンスのプライマーを混ぜても大丈夫 なのでしょうか？あらかじめセンスとアンチセンスを 等量混ぜたプライマー液を作っといて、反応液に混ぜれば 良いのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- RNA抽出
RT-PCRで、各組織でのRNA発現量の定量、比較を行っています このPCRのときに、RNA抽出物にDNAのコンタミがないかどうかチェックするためにネガコンとしてｃDNA作成に利用したRNA抽出物を一緒にPCRを行っているのですが このRNA抽出物（吸光度で濃度が1,9）にもｃDNAのものと同じ位置にバンドが出てしまいます PCRのプライマーは、イントロンを２ヶ所はさむように設計しているので、RNA抽出物にこのようなバンドが出てしまうのが理解に苦しんでいます RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません 脳、肺ではこのRNA抽出物ではバンドが出ず、発現が高いと思われる肝臓でバンドが見られる（２回RNA抽出を行って2回とも）ので、このことも関係しているのでしょうか？？ このバンドがなくなるまで定量はできないのでしょうか？ アドバイスをいただけたら幸です
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAの電気泳動と吸光度での定量
こんにちは！ アルカリミニプレップで精製したＤＮＡの濃度を分光光度計で測定しました。 その結果をもとに電気泳動したところ、予想していたバンドよりも急激にうすいバンドが出てきました。 バンドの濃さから考えると、分光光度計で測った時の24分の1くらいの濃度しかありません。 分光高度計での測定を間違えたのかと思いやりなおしましたが、出た数値に変化はありませんでした。 どうしてこのような事がおこるのでしょうか。 分光光度計で得られる数値は正確ではないのでしょうか。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
ありがとうございます。説明不足ですみません。 リアルタイムPCRの説明書に「ｃDNAは1反応系につき100ng以下にする必要がある」とあり、また「リアルタイムPCRでサンプル間の比較をする際、ｃDNA量をそろえて行うことが望ましい」とあったため、ｃDNA濃度を測定しようとしていました。ただ単純にｃDNA溶液の吸光度から濃度を知ろうとすると、そこにはプライマーやｄNTPも影響してくるとのことでしたので、ｃDNA溶液を作成する際にゲノムDNAコンタミチェック用に作成したRT(ー)のサンプル（同量のｄNTPやプライマーが入っている）をブランクとしておけば、もしかしてある程度ｄNTPやプライマーの影響を減ずることができるのかなと素人考えをして、質問させていただいた次第です。 ただ、お答の中の「ハウスキーピングジーンを複数コントロールとして増幅し補正するのが一般的」との部分に納得致しました。