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DNAの回収について
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GENECLEANって回収悪いですよね。 （うっている会社には怒られてしまいそうですが・・・。） わたしも、昔やって、うまくいかなかった経験があります。 ガラスビーズが最終的に混ざるし。 もしも、ほかのKITをためす気があれば、QIAGENのQIAEX GEL Extraction Kitをおすすめします。すごく簡単できれいに確実にとれます。 １５０個で２５０００円なので、コストパフォーマンスもまずまずです。 古典的な方法でもよければ、フェノール抽出法でしょう。 １．低融点アガロースで、泳動して、切り出したら（できるだけ小さく切るのがポイント）、３００マイクロリッターになるようにTEバッファーを加えます。 ２．６５度で溶けるまで（～１０分）インキュベートして、溶けたらすぐに、等量のTE飽和フェノールを加え、よく混ぜて、１５０００rpm、室温で５分遠心します。 ３．上清を新しいチューブに移し、再度、等量のフェノールを加え、よく混ぜて、15000rpm、室温で５分遠心します。 ４．上清を新しいチューブに移し、等量のクロロホルム（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、よく混ぜて、１５０００rpm、室温で５分遠心します。 ５．上清を新しいチューブに移して、1/10の３Ｍ酢酸ナトリウム(pH 5.2)と３倍量のエタノールを加え、-80度、２０分（-20度なら、もう少し長め）冷やして、15000rpm、4度で２０分遠心します。 ６．上清を捨てて、７０%エタノール100マイクロリッター加え、再度15000rpm,４度で５分遠心して、上清を捨て、乾かしたら、TEバッファーに懸濁して終了です。 フェノールは手に付けるとやけどしますので注意してください。 この方法はなれればすごく回収率もいいですが、やっぱりおすすめは、QIAGENのKITかなあ。
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ライゲーションが上手くいかないのではなく回収段階ですね。 鉄則 上手く出来る人と一緒にやる。 方法やkitを換えてみる。 量だけの問題でしたら。スタートマテリアルの量を増やす。 配列によっては回収率が悪いものもあるのでポジコンで確認を。 ライブラリーの作製ではないですよね。 具体策（簡単に） 加温時間を長く 洗いは慎重に 溶出volを下げることで（同じ回収量だとしても）濃度を上げて、ライゲーション時に高濃度で持っていく。 まわりも駄目な時はビーズが変になっている（原因不明）の場合あり。 わかりにくければ補足要求してください。
お礼
二度にわたるアドバイス、ありがとうございました。
- m_nkgw
- ベストアンサー率47% (42/89)
私もGEANCLEAN IIを使って精製していました。（卒研時） やはり収集率が悪かったので、ガラスパウダーを洗浄してDNAを回収するループを１回多く回していました。 ただし、最後の１回分は不純物が心配だったので、別に保存し、最初の産物の結果次第で使ったり使わなかったりしていました。 でも、あまりおすすめできませので、収率を上げるためにはKITに頼らないプロトコルをお勧めします。手元にメソッドがないので直接的な資料を提示できませんが、指導教官に相談するか、DNA抽出を専門的に扱っている大学研究室に電話をするかメールをして、代表的なプロトコルを薦めてもらってください。
お礼
アドバイスありがとうございます。 でも、DNA抽出を専門的に扱ってる研究室ってうちなんですよね。 しかも大学じゃなくて国立の機関で（笑） まあ、私の経験不足が一番の原因かもしれないですね。
- you-net
- ベストアンサー率0% (0/2)
以前、卒論でDNA Seqenceのしていたんですが、dsDNAの単離の際にジーンクリーンを使ったことがあるんですが、回収率が悪く(泳動ゲルから分離すること自体がコンタミの原因だったような)、２．３度試してやめた覚えがあります。当時のプロトコールを見たんですが、もう５年も前のことで英語のプロトコールを読めませんでした。どうもゴメンナサイ。
- knightgold
- ベストアンサー率21% (6/28)
質問なのに質問で返すのは良くないですが、これは大腸菌でＤＮＡを増殖させて これをキットで回収しているのですか？？ もしそうならば、 １ 大腸菌濃度が濃かったり、薄かったりしている ２ 大腸菌君自体の調子が良くない ３ 大腸菌中のＤＮＡの増殖が極端に少ないか、 多くなっている。 というのが考えられます。 次に、プロトコールをもう一度良く読んで実験方法があっているか確認 しましょう。 使用するプラスミドの種類によっては、使用する試薬、量、濃度が違ってきま すので確認しても良いと思います。あとＤＮＡの長さでも同じ。 んんーでも一応ＤＮＡは少しながら回収出来ているのだから、回収する物自体が やっぱり良くないのでは？？ 昔、植物のＤＡＮを、フェノール抽出法で行っていたのだが、（フェノールが手にこぼれたりして怖かった）、温度とかには注意してましたからね。 あと鳥のＤＡＮを取っていた時も、核が多い肝臓を使って採取してましたからね。 昔の実験を参考にしました。 もしよかったらGEANCLEAN II KIT の簡単なプロトコール教えて下さい。
補足
アドバイスありがとうございます。 私の質問が大雑把なため誤解が生じたかもしれませんが、 質問のDNAの回収はライゲ－ションの前の段階で、 ゲルから切り出したDNAを精製する段階のことです。 GEANCLEANはNaIでアガロースを溶解させ、DNAをガラスパウダーに 吸着させて回収する方法です。
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