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primerの設計について

RT-PCRによりmRNAの発現を見るために、プライマーを設計しているのですが、設計で特に注意すべき点を教えてください。例えばGC含量50%にするなど。他にもありましたらどんな情報でも良いです。お願いします。

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  • 生物学
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  • 回答No.2
  • ras07
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すでに回答されてる方の補足をさせていただきます. (1)プライマーは,目的の遺伝子に特異的に結合しなければいけないので,十分な長さをもつ必要があります.だいたい20塩基前後でデザインして,データベース検索を行い,特異的であることを確認してください. (2)2つのプライマーの長さは,違っていてもかまわないので,Tmを近づけてください. (3)3’側の最後の塩基は,GかCがよいとされています(3重結合なのでAやTよりも強い). (4)プライマーダイマーを形成しない配列であることも重要ですが,プライマーがループなどの2次構造を形成しないような配列にすることも重要です. (5)RT-PCRの場合,鋳型にゲノミックDNAが含まれていると,ゲノミックDNAも増幅してしまうことがあります. 逆転写前にDNAaseを使ってゲノミックDNAを除去する方法もありますが,DNA分解中にmRNAも一部分解してしまうことがあるようです. 別の方法としては,イントロン領域をはさんで,2つのエクソンにまたがるようにプライマーを設計する方法があります.20塩基のプライマーの場合,約10塩基ずつを振り分けるようにしてください.

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質問者からのお礼

ありがとうございます。 ゲノミックDNAの増幅には注意が必要だということがわかりました。

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  • 回答No.1

私はRTはしたことがないのですが、通常のPCRの プライマー設計において注意しているのは以下の点です。 1.プライマーが自身のプライマーと相補的な配列を持たないこと。(プライマーダイマーを形成しない) 2.forward, reverseのプライマーの3’末端が相補 的でないこと。(5’末端はあまり気にしてないです …5’末端でくっついても増えないから) 3.forward, reverseのTm値が近いこと。 ほかにも5’末端はGC含量が高めで3’末端は低めが いいそうですが、上記の3点をみたすので精一杯な ことが多いです。

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質問者からのお礼

ありがとうございます。 とても参考になりました。

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