primerの設計について

質問

RT-PCRによりmRNAの発現を見るために、プライマーを設計しているのですが、設計で特に注意すべき点を教えてください。例えばＧＣ含量50％にするなど。他にもありましたらどんな情報でも良いです。お願いします。

回答No.2

ras07 · ベストアンサー

すでに回答されてる方の補足をさせていただきます．

(1)プライマーは，目的の遺伝子に特異的に結合しなければいけないので，十分な長さをもつ必要があります．だいたい20塩基前後でデザインして，データベース検索を行い，特異的であることを確認してください．

(2)２つのプライマーの長さは，違っていてもかまわないので，Tmを近づけてください．

(3)３’側の最後の塩基は，GかCがよいとされています（3重結合なのでAやTよりも強い）．

(4)プライマーダイマーを形成しない配列であることも重要ですが，プライマーがループなどの２次構造を形成しないような配列にすることも重要です．

(5)RT-PCRの場合，鋳型にゲノミックDNAが含まれていると，ゲノミックDNAも増幅してしまうことがあります．

逆転写前にDNAaseを使ってゲノミックDNAを除去する方法もありますが，DNA分解中にmRNAも一部分解してしまうことがあるようです．

別の方法としては，イントロン領域をはさんで，2つのエクソンにまたがるようにプライマーを設計する方法があります．20塩基のプライマーの場合，約10塩基ずつを振り分けるようにしてください．

お礼

ありがとうございます。
ゲノミックＤＮＡの増幅には注意が必要だということがわかりました。

回答No.1

yokochoco

私はRTはしたことがないのですが、通常のPCRの
プライマー設計において注意しているのは以下の点です。

１．プライマーが自身のプライマーと相補的な配列を持たないこと。（プライマーダイマーを形成しない）

２．forward, reverseのプライマーの３’末端が相補
的でないこと。（５’末端はあまり気にしてないです
…５’末端でくっついても増えないから）

３．forward, reverseのTm値が近いこと。

ほかにも５’末端はGC含量が高めで３’末端は低めが
いいそうですが、上記の３点をみたすので精一杯な
ことが多いです。

お礼

ありがとうございます。
とても参考になりました。