• 締切済み
  • 困ってます

RT-PCRでのプライマー設計

生命理工学部の三年生です。 RNA発現量をみるためにRTーPCRを使うのはわかるのですが、このときなぜプライマーの設計をイントロンをはさむようにしなければならないのかがわかりません。どなたかご教示お願いします。

共感・応援の気持ちを伝えよう!

  • 生物学
  • 回答数1
  • 閲覧数1847
  • ありがとう数2

みんなの回答

  • 回答No.1

cDNAでなくゲノムから増幅されるシグナルを抑えるためです。イントロンは非常に長いことが多いのでゲノムからのシグナルが得られないか、違う場所にバンドが現れるので区別することができるなどの利点があります。RT-PCRもリアルタイムかどうかで少し考え方が変わってきますが、基本的にはおなじです.cDNAを作る時あらかじめDNase処理をするのでその必要があるのかという疑問もあるでしょうが、以下のように考えられます。PCRは1コピーでも増幅可能です。ゲノムが1コピーも残らずDNaseで切られている保障はありません。例えばゲノムがあるサンプルは1コピー残っていてほかは2コピー残っていればベースラインが2倍違ってきます。イントロンをはさんでおくとプライマーではさんだ間のゲノムの長さが長くなるのでDNaseによる分解で生き残るゲノムの量も極端に落ちるのでコンタミを検出する確率も極端に落ちます。 あとRNA精製で、ゲノムのコンタミは避けられないものと考えてください。最近改善されたキットが出ているようですが、現状は把握していません。

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

質問者からのお礼

ありがとうございました。これからも勉学に励んでいこうと思います。

関連するQ&A

  • RT-PCRにおけるプライマー設計について

    はじめてお世話になります。 通常のPCR時におけるプライマー設計は理解できるのですが、RT-PCRにおいては、はじまりが1本鎖のcDNAであるということでひっかかりを感じます。 cDNAの塩基配列がわかっていますのでそれをもとに遺伝子解析系のソフトを用いてプライマーを設計したところ、sense-primerの配列が、cDNAの相補鎖となるものと相補的になっていました。(anti senseのほうはcDNAと相補的だったのですが) 実験書を読むとsenseがまずcDNAとアニールして2本鎖になってから通常のPCRがはじまるというふうに理解できましたので、上記のプライマー設計ではPCRがおこらないということでしょうか? この場合はcDNAの相補鎖に対してプライマー設計をおこなえばよいのでしょうか。 それともこのままのプライマーでよろしいのでしょうか? よろしくお願いいたします。

  • primerの設計について

    RT-PCRによりmRNAの発現を見るために、プライマーを設計しているのですが、設計で特に注意すべき点を教えてください。例えばGC含量50%にするなど。他にもありましたらどんな情報でも良いです。お願いします。

  • RT-PCRとリアルタイムPCRのプライマーの違い

    初歩的な質問ですがご助言願います。 リアルタイムPCR用に設計したプライマーを用いて RT-PCRをかけようと思うのですが そもそも、この2つのPCRのプライマーに設計上の違いはあるのでしょうか? 違いがあれば、RTではうまくいかないのでは?と思っています。 ちなみにこのプライマーでできるターゲット産物のサイズは400bp程度です。

  • GAPDH用 プライマー設計方法について(RT-PCR用)

    Humanの細胞から作成したcDNAを用いてRT-PCRを行う予定にしております. cDNAが正しく生成されていることおよび発現を検証したい領域がおよそ150bpのため,150bpほどのGAPDH(or β-actin)のPrimerを作成しよう考えています. GAPDH用のプライマーはどのように作成すればよいのでしょうか? Web検索などで450bp程度のPrimer情報は見つけることができたのですが,どのように設計したのかが不明でした. 指定したサイズのGAPDHのプライマーの設計方法をご存知の方がいましたらお教えください.

  • RT-PCR

    RT-PCRでcDNAの作成を行っています 通常は、 RNA抽出物を逆転写して (polyA primerで) PCRへもっていっています。 しかし 先日ふと思い立って、 RNA抽出物を鋳型として そのままPCRしてみました。 すると、このRNA抽出物を鋳型としてPCRした場合も、 cDNAを鋳型とした時と同じ位置にバンドが出てきました。 このバンドは、鋳型RNAをRNAse Aで処理すると消えます。 このPCR産物の シークエンスをチェックしてみると、 目的遺伝子であることが確認できました。 (全長800bpの中の500bpのシークエンスを確認) RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています。 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません。 この場合、 RNAを鋳型として 目的遺伝子が増幅しているのでしょうか? あるいは、 ゲノムDNAがコンタミが原因で イントロンを含んだものが増えているのでしょうか? 通常、 DNA polはRNAを鋳型として 遺伝子増幅できないといわれていますが、 本当でしょうか? 何か参考になる文献があれば 教えていただけないでしょうか? よろしくお願いいたします。

  • RT-PCRのプライマー

    RT-PCRの逆転写反応の際に使うプライマーについての 質問です。プライマーは、Oligo dT primerか、ランダムヘキサマー プライマーのどちらを使っていますか? また、どこの会社からプライマーを購入しているか教えて 頂けたら助かります。

  • RT-PCRについて

    RT-PCRの質問です。 RNAからcDNAに逆転写するときに、Randam Primerと いうものがありますが、これってランダムにRNAに くっつくのですよね?だからいろんな長さのcDNAが できてしまうと思うのですが、Randam Primerを使っても 大丈夫でしょうか?Randam Primerの他に、オリゴdT Primer というのもありますが、どっちが逆転写に良いのでしょうか? あと、cDNAを増幅させるときのPCRで、遺伝子特異的な プライマーを使おうと思うのですが、1つのサンプルに センスとアンチセンスのプライマーを混ぜても大丈夫 なのでしょうか?あらかじめセンスとアンチセンスを 等量混ぜたプライマー液を作っといて、反応液に混ぜれば 良いのでしょうか?

  • エクソンとイントロンについて

    Igf1rという遺伝子の各組織でのRNA発現量を見るため、RT-PCRで定量したいので、そのPCR用のプライマーをイントロンをはさんでつくりたいのです そのために、イントロンの部位とその配列の長さ、目的のエクソンが、Igf1r遺伝子上の何塩基目から存在しているかなどを知りたいのですが、調べ方が分かりません アドバイスをいただけたらありがたいです

  • RT-PCRが上手くできないのですが

    RT-PCRでポジコン(GAPDH)を含めたバンドが検出されません。 RNAはキットの製品を使用し、OD260/OD280で2程度、電気泳動でRNAを確認しました。(poly-Aに精製してません) cDNAの作成もキットで、Randam hexamer primerを使用しました。 PCRは論文に掲載されているprimerと条件で行いました。 cDNAが上手く出来ていないのかprimerがいけないと思うのですが、このような状態でどのような原因検索をしたらよいでしょうか? また、primerはcDNAという1本鎖のDNAに対してでもsenseとanti-senseのペアーが必要なのはなぜでしょうか?

  • PCRのプライマーって

    ある遺伝子をゲノムからクローニングしてきてタンパク発現を行おうとしています。 しかし、PCRの段階でcDNAが増えません。 増えない理由として、プライマーの設計が間違っているからと指摘を受けました。遺伝子操作にはだいぶブランクがあるので、あまり自信がないのですが、 例えばgenebank などで検索したある遺伝子の配列が AGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTAG だとすると、 AGT側が5’TAG側が3’だという事で 5’側プライマー AGTGGGGG…→ 3’側プライマー CTACCCCC…→ と設計しました。 しかし、シーケンスの5'と3’を逆に捕らえていると指摘されたのですが…。 私の理解は間違ってたんでしょうか。 そんなことないと思うんですが・・。 ちょっと自信がなくなったので聞きに来ました。 よろしくお願いします。