PCRについて質問です。

質問

教室ではApplied BiosystemのStep One Plusを用いてＰＣＲを行っています。PCRは、上司から特にStandardを設定しなくても、問題ないと最初指示されていましたので、これまで特に気にせずＰＣＲを行っていました。これまで、細胞実験を中心に行っていましたので、結果も安定しており、特に結果に疑問を持たずに実験をしていました。これが問題だったと反省していますが、最近臨床検体（組織生検検体）を用いて、実験を行うようになりました。すると、検体間のばらつきが激しく本当にこれでいいのか疑問を感じるようになってきました。GAPDHをコントロールにしていますが、GAPDHすらも、数サイクルのずれは各サンプル間でざらに生じています。targetとしている遺伝子も当然かなりの差があります。なかには、検体のquolityが悪く、PCRがかからないものもあります。サンプル不良がある程度存在することは、実験の性質上仕方がないと思っていますが、このまま実験をすすめて大丈夫なものでしょうか？結果だけみますと、予想していた、臨床的データと相関があり有用な結果になっているのですが。。。すでに、かなりのPCRをかけてしまい、やり直すにもかなりの時間が必要で悩んでいます。上司は、結果が良いからまあ良いのではというあいまいな返事です。使用しているprimerのPCR効率は比較Ct法に用いても問題ないものと判断しています。　Standard curveはやっぱり必要でしょうか？それとも、相対的評価だから、あまり大きな影響はないでしょうか？乱筆大変失礼しますが、教えていただければ幸いです。

回答No.1

larme001

PCRで何を評価して、どのような位置づけでの実験なのかとかにもよって実験のウエイトは変わるとおもうのですが、、、一般的に考えると、

＞＞なかには、検体のquolityが悪く、PCRがかからないものもあります。サンプル不良がある程度存在することは、実験の性質上仕方がないと思っていますが、このまま実験をすすめて大丈夫なものでしょうか？

という時点で、実験が再現できない場合があるわけなのですから再現性の取れるような条件になるようにRT-PCRの抽出条件や試薬等を最適化する必要があるでしょう。だって、そうじゃなかったら結局実験にならんでしょうから、実験の性質上云々といってもしょうがないですよね。できないなら「できるような条件をさがす」か「別の方法で行う」のどちらかしかありません。まあ、もちろんその実験に求める信頼性と、あなたの価値観とかラボのスタンスなどにもよるでしょうが、、、まあサンプルがなんにせよPCRはきちんとRTをかければプライマーが悪くなければかからないということはあまりないと思いますけどね。まあ実験の腕の問題なのかどうかを知るためにも毎回ポジコン等をおいておくのが重要かと思いますけどね。

>使用しているprimerのPCR効率は比較Ct法に用いても問題ないものと判断しています。Standard curveはやっぱり必要でしょうか？

判断基準が妥当かどうかわかりませんが、それなら絶対定量でもしない限りstandardはなくていいでしょう。そもそもスタンダードを省略する意味でdCt法を用いるのですからね。

前後しますが、
＞GAPDHをコントロールにしていますが、GAPDHすらも、数サイクルのずれは各サンプル間でざらに生じています。targetとしている遺伝子も当然かなりの差があります。

結局、、、どういう状況がよくわからないのですが、そもそも検体間のずれを補正するためにGAPPDHなどのハウスキーピングで補正するのではないでしょうか？まああまりにもずれている場合は少し疑わしくもなるでしょうが、検体がどうしても少ないなら多少はやむおえないでしょう。その分nを増やして再現性があることがわかればいいと思います。ただ、GAPDHが妥当かどうかはわかりません。

ちなみにあまりにもぶれるというのであればおそらくRTの段階で上手くいっていない（蛋白の持ち込み等が激しかったり、極端にサンプル間でのRNAの抽出効率が違うとか）とおもいますので、そう言う場合はやっぱりその段階での条件を最適化する必要があると思います。最近はかなり少量でも綺麗に取れるというキットとかもでているでしょうからそういうのをやるとか、もしフェノール系の遠心で抽出するやつでやっているならカラムのものにしてみるとかで綺麗になるかもしれません。あなたの立場がどうかわかりませんが、良くないものは良くないならまあきちんと条件検討したい旨上司に相談するのはしょうがないと思います。少なくとも結果の責任の所在も含めて、RNAの純度などのデーターとかそういうものをきちんと整理してから自分の考察を含めて、それでどうするかを最終的に上司にディスカッションするのがいいのではないかと思います。実験結果に信頼性がないのに見て見ぬふりをするのは、結局後で問題になった時に自分のせいになるので、やっぱりそこに自信がないならやり直すか、それに手間がかかるというならどうするべきかは上司にきちんと状況を理解させた上で決めるべきことでしょう。勝手に判断しても、上司はあなたの腕が下手くそなだけだとおもっていて、そもそも実験系自体が今のプロトコルでは再現性がイマイチということ自体を「知らなかった」と言えばあなたの責任になってしまうかもしれませんからね。

いずれにせよ、データの解釈に関してはreal time pcrについてもう少し勉強する必要はあるかもしれませんね。まあどういった立場なのかわかりませんが。

お礼

RNA抽出はキットを用いて行っていますが、5ng/mlなどほとんど取れない場合があります。純度も悪いものもあります。RNA抽出は検体を共用していますので他者がとったものも多いので、どうしようもないです。結果的に数％の症例が測定不良に陥っており相談させていただきました。不良なものでもPCRの段階で、少しでも精度が上がらないか相談させていただいた次第です。勉強します、ありがとうございました。