細胞培養について。パスが上手く出来ません。

質問

閲覧ありがとうございます。
数週間前にバイオ系の研究室に配属されました、大学３回生の者です。

癌細胞（浮遊、接着）を細胞培養専用のフラスコを使って培養しています。
細胞が増えたらチューブに移して遠心にかけ、上清を吸って培養液を入れ数個のフラスコに分けるのですが、
その分けた後のフラスコを見ても細胞が全くない、あるいは非常に少なくそれからは育たずに消えて（死んで？）しまいます。

遠心後の時点でチューブの底にペレットはあるので、おそらくその後の操作が悪いのだと思います。
オートピペッターを使ったピペッティングが上手く出来ていないからと思いましたが、移した後でチューブを見てもペレットは残っていないようです。ピペッティングの際は、培養液をチューブに入れるときに少し入れた後、数回液を吸ったり出したりしてから全て出しています。

それなら上清を吸うときにペレットも吸ったのかなとも思いましたが、もちろんパスツールをチューブの底まで突っ込むような事はしていません。チューブを傾けて、パスツールを壁に当てるようにして吸っています。

おそらくこのどちらかが原因だと思うのですが・・・
自分なりに慎重に操作しているつもりですが、どこが悪いのかわかりません。

熟練した方に見て頂けたら一番良いのですが、先輩や先生は自分の研究で忙しそうなので頼みにくいです…
細胞を使わずクリーンベンチ内で練習した時は見て下さいましたが、特に悪かった訳ではなさそうでした。

研究室での課題が進められず、本当に困っています。
全くの初心者なので、用語が間違っていたり言葉足らずでしたらごめんなさい。

細胞を使った研究などをされている方から何かアドバイスを頂ければと思い、質問させて頂きました。
よろしくお願いします。

回答No.5

noname#250373 · ベストアンサー

No.1です。やっぱり吸っちゃってましたか（汗

・遠心終了後、時間が経つとペレットが緩んでしまいます。遠心後はできるだけ速やかに上清を除去すると良いですよ。

・遠心管を遠心機から取り出す際や運ぶ際など、ペレットが乱れないように優しく扱ってみて下さい。

・先輩に聞かずに失敗するよりは、聞いた方が絶対良いです！変に遠慮するとお互い損です。
　また聞くだけでなく、操作を見せてもらうのもいいと思いますよ^-^

頑張って下さい！

お礼

初めに的確なアドバイスをしてくださったw6o6nさんをベストアンサーに選ばせて頂きます。
あれから自分のどこが悪かったかを見直し、ようやく成功しました。
まだまだ不慣れですが、これからも与えられた課題を頑張ってこなそうと思います。

お時間を割いて回答して下さった皆様、本当にありがとうございました。
今後の参考にさせて頂こうと思います。

回答No.4

yuklamho

トリプシンの処理が長すぎたりピペットで激しく若しくは長時間混ぜすぎて細胞が死んでしまっているのかもしれませんね。

「あるいは非常に少なくそれからは育たずに消えて（死んで？）しまいます。」
よく分かりませんが、接着系だったら少しでも細胞があるようでしたら諦めずにずっと飼ってみたらどうですか？多分増えてくると思うのですが。

「熟練した方に見て頂けたら一番良いのですが、先輩や先生は自分の研究で忙しそうなので頼みにくいです…」
気持ちは分かりますが、一度くらいは観てもらいましょう。

単に、細胞を維持していきたいだけなのですよね？
だったら、例えば接着系の細胞の場合、10cmディシュだったらトリプシン-EDTA液を1mL入れてインキュベーターに1，2分入れておいてから培養液を5－10mL加えてピペットで懸濁して、10mLの新しい培養液を加えた新しい培地にその細胞の液を1,2mL加えれば問題ないし(トリプシンは希釈されるし培地には高蛋白質のFBSが入っているはずなのでトリプシンは不活化されます)、浮遊系の細胞なら増えた細胞の培地から1mL取って10-20mLの新しい培地に加えて培養すれば問題ないです。

ただ、先輩や先生はこういったやり方を嫌がるかもしれません。

お礼

回答ありがとうございました。
処理にトリプシンは使っていませんが、ピペッティングのし過ぎは考えられるかもしれません。

培養液の一部をとって新しい培地に移すやり方は、私の研究室では誰もしていないそうです…

回答No.3

hiddenleaf

ペレットを吸うというのは考えにくいですね。
心配なら適当なビーカーにデカンタで上清を捨ててみたらいかがでしょうか。
ただの継代なら上清をギリギリまで吸う必要はないですよ。

あと考えられるのは
接着細胞であればトリプシン処理のし過ぎで細胞が死滅
遠心分離の回転数が高すぎて細胞が死滅
くらいでしょうか。

なんにせよ、慣れないうちは継代後もサンプリングをして
トリパンブルー処理後、細胞数を測定した方が良いですよ。

お礼

遠心分離の回転数や、接着細胞の処理（EDTAのみです）は同じ細胞なら全員共通なのでおそらく問題ないと思います。
今まで上清をかなりギリギリまで吸っていましたが、少し余裕を持っても大丈夫なのですね。
細胞数のカウントは、課題に含まれているのでいずれやります。

回答ありがとうございました。参考にさせて頂きます。

回答No.2

ga111

細胞の濃度（密度）が低いと、生育に支障がでることがあるので、まず、あまり薄めないようにします。

培地、まちがっていませんよね。また遠心で死ぬ可能性があるので、遠心しないで、単に、１枚のシャーレから２枚に分けるとか。古い培養じょうせいをわざと、持ち込むようにします。私はフラスコより１０ｃｍなどのシャーレが好きですね。私は、増やすとき遠心しませんけど。

お礼

まだ操作に不慣れの為、細胞濃度は少し濃くなるようにしています。
培地は全員共通です。（名前ははっきり覚えていません、すみません。）
遠心はしないに越したことは無い気がします・・・

回答ありがとうございました。

回答No.1

noname#250373

上清を吸うときにペレットも吸っている可能性が非常に高いです。

吸引力が強いと、多少ペレットから離れていてもズルっと吸ってしまいます。
ペレットの近くまで上清を吸ったら、パスツールピペットを上清に差し込んで吸わず、液表面から少しずつ吸うのがコツです。
吸引時にペレットを凝視し、最後までペレットが吸い込まれていないことを確認して下さい。

念のため、遠心機の設定を確認してみて下さい（低速遠心で落ちるのでまず大丈夫と思いますが）。

補足

回答ありがとうございました。

どうやら、ペレットも吸っていた事が一番考えられる原因の様です。
今日パスする際に、接着細胞と浮遊細胞を同時に遠心しましたが、遠心後クリーンベンチに戻す際に底のペレットが浮いてしまいました。
接着の方はペレットがはっきりと確認できたため、（今のところ）成功しましたが
浮遊の方はおそらく吸ってしまったようで失敗しました。

遠心後ペレットを浮かないようにするには、やはり慎重に動かすしかありませんか?
浮いてしまっても、もう一度遠心するわけにはいかないので・・・