細胞培養がうまくいきません。

質問

接着性の細胞を液体培地で培養していますが、コンタミして困っています。
培養液には、抗生物質、抗真菌剤を加え、実験で使う器具はＵＶ照射して使用しています。
培養容器は、フラスコです。インキュベーター内では、キャップを緩めて細胞が呼吸できるようにしています。
インキュベーターの湿度を保つために滅菌蒸留水を入れ、ＳＤＳを加えています。
ここで、ふと疑問なんですが、インキュベーター内でキャップを緩めなくてはならない場合は、アルコール消毒してからインキュベーターに入れたらよいのでしょうか？しなくてもよいのでしょうか？
現在は、インキュベーター内にフラスコを入れる際に、70％エタノールを吹き付けて入れているんですが、これだと、カビが生えてしまいます。（フラスコの外側に）

回答No.4

noporih · ベストアンサー

まず下でfujishiroさんがおっしゃっている通り、培養液がコンタミしていないかを調べてみるべきだと思われます。冷蔵庫に入れてあると菌が繁殖しづらく、確認しづらいので、一日、室温に置いておきます。翌日、ビンを振ってみて白いものがユラユラとしていたらコンタミってことになります。

僕は使用する器具・試薬はすべて乾熱滅菌・オートクレーブ・ろ過滅菌を行っています。そして、たとえエタノール消毒していたとしても「手が触ったところは菌が付いている」と思ってそれらを使用しています。
あと以外と気が付かないところが原因だったりします。例えば誰かがピペット操作のときにニップルまで培養液を吸い上げてしまったのに、それに気づかず放置。後の人がそれを使ってコンタミだらけ・・・なんてこともあると聞きます。

あと、インキュベートについてですが、基本的に外側を消毒しなくても中身は平気です。70％エタノールを吹きつけてカビが生えるということはインキュベーター内の環境がよくないのではないでしょうか？一度、チェックしてみて、必要があれば掃除・滅菌をした方がいいでしょう。他の実験者の方（操作に慣れている方）のディッシュにも同じことが起こっているのでしょうか？

ちなみに失礼ですがkumanokophooさんは培養を始めて間もなかったリするでしょうか？始めのうちは気をつけているつもりでも、どうしてもコンタミの洗礼を受けてしまいます。でもしばらくすると慣れてきて失敗しなくなりますよ。

お礼

回答ありがとうございます。

＞冷蔵庫に入れてあると菌が繁殖しづらく、確認しづらいので、一日、室温に置いておきます。翌日、ビンを振ってみて白いものがユラユラとしていたらコンタミってことになります。

なるほど・・・。こうすればコンタミしているかわかるんですね。
さっそく培養液を外に出してみます。

＞ピペット操作のときにニップルまで培養液を吸い上げてしまったのに、それに気づかず放置。後の人がそれを使ってコンタミだらけ・・・

これ、あるかもしれないです。フィルターを取り替えないといけないですね。

細胞培養は今回が初めてです。コンタミはつきものだと言われるんですが、こうもコンタミばかりさせていると、だんだんと肩身も狭くなり・・・と最近では培養をしたくないとまで思ってしまいます。

もう一度、徹底的な掃除から始めて、１つ１つの操作に注意を払って気をつけながら培養をしてみようと思います。

ありがとうございました。

回答No.3

fujishiro

培養液はどのような滅菌をしていますか？市販品ですか？フィルター滅菌ですか？培養液自身がコンタミしている恐れはありませんか？
器具はガラス容器ですか？プラスチック制ですか？乾熱滅菌、もしくはオートクレーブはできない状況なのですか？
細胞の親株自体がすでにコンタミしているというオチはありませんよね？
インキュベーターにカビがこびりついているということはありませんか？

以上を徹底的に一度チェックしたほうがよろしいでしょう。
ちなみに私はデイッシュを使っています。デイッシュのふたはわずかに容器とすきまがありますがなにもおこらないのでフラスコの蓋が若干開いている程度が直接の原因ではないと思います。状況がわかりませんので自信はなしです。

お礼

回答ありがとうございます。
培養液は市販品を使用しています。
それに付属の抗生剤を添加するものです。
器具は、プラスチック製フラスコを使用しています。全ての器具はプラスチック製で使い捨てです。
細胞の親株は、凍結で市販されているものを使用します。

ですが、インキュベーターにカビ・・・発生します。
カビが発生したら、洗浄するのですが、しばらくするとまたカビが発生します。
カビがこびりついている可能性があるんですね・・・。
機器が古く、インキュベーター内、クリーンベンチ内に錆があるんですが、こすっても落ちません。
このさびも影響あるのでしょうか？
徹底的にしらべてみます。

回答ありがとうございました。

回答No.2

nazenani

まず、いつも同じ菌でコンタミしてるかどうか確認したがいいと思います。
私は以前大学で熱耐性菌を培養していたのですが、共同利用していたほかの方が
私の菌でよくコンタミしていました。通常、機器は熱殺菌をメインで行って
いたのですが、熱に強いため火炎滅菌でもしない限り死んでくれてませんでした。
でも、ガス滅菌だと普通に死んでいました。
Hiyukiさんがいつも同じ菌にやられているのなら、その菌の耐性が弱いもので
処理すれば大丈夫と思います。

お礼

回答ありがとうございます。

インキュベーターの共同利用は・・・これも考えられることですね。
今まで、その菌のフラスコだけでインキュベーターをしようしたことはないです・・・。

回答No.1

Hiyuki

私も以前、実験実習で菌の培養をしたことがあります。無菌空間を作るのは、そんなすごい薬品とかは
使わず、超原始的な方法でしたね。

ものを入れる際には、必ずエタノール(99.5％)で消毒するか、金属はアルコールで消毒したあと、ガス
バーナーで軽くあぶってから入れました。そして、入れる際には、自分の腕も肘ぐらいまでガーゼに含
ませたエタノールで消毒して、無菌空間に入れました。肘ぐらいまでしか、無菌空間に入れないので、
これでOKでしたね。
まあ、機材とか目的も違うので、あまり役に立たないはない話かも…。

あと、こんなサイトもありました。

参考URL：

http://www.kochi-u.ac.jp/~kazuk/baiyoh.html

お礼

回答ありがとうございます。
エタノールで消毒して、ＵＶ照射をして・・・さらに、使用前のピンセットは火炎消毒して・・・と心がけているんですが、どこかで埃がはいってしまうのかも・・・・と考えると、細胞培養って本当に細心の注意が必要ですよね。
さっそく教えていただいたサイトを拝見させていただこうかと思います。

ありがとうございました。