染色体観察の問題と考察
- 研究室で行っている染色体観察の実験で問題が発生しています。
- 操作手順に従い実験を行っても、細胞が固定液と混ざらずに複雑な層状になり、染色体が観察できません。
- 考察を行った結果、細胞が大きいために低張処理が過剰になり、細胞膜が破壊されている可能性があります。
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染色体の観察
私は研究室で、Molt-4/HTLVIIIBという細胞の染色体を観察する実験をしているのですが、どうしても実験がうまくいかないので質問させていただきます。 染色体を観察する際の前処理（スライドグラス展開まで）として、 1．細胞を培養 2．コルセミド処理 3．低張処理 4．固定 という操作を行います。実際には３と４の操作の間に半固定といって、低張液に細胞が沈殿している状態でカルノア固定液を少量加え、遠心する操作があります。私が調べた結果では、この操作で遠心したあと、細胞はチューブの底に沈殿するそうなのですが何故か私が操作を行うとチューブの上から、 低張液→白層（細胞層？）→カルノア固定液 の三層となってしまいます。このまま操作を続け、スライドグラスに展開して観察しても、固定液が100%でないからなのか、細胞が破壊されているからなのか、細胞の何だかわからないような雑多物や固定液の結晶のようなもので、観察どころではなく染色体は見つかりません。 他のサイトでも質問し、ピペッティング不足ではないかと助言をいただいたので試してみましたが効果はありませんでした。 この件について自分なりに考察してみたのですがどうでしょうか？ 1．Molt-4/HTLVIIIBは比較的大きな細胞なので、低張処理の際に低張液をたくさん細胞内に取り込むので、遠心してもチューブの底に沈殿しない（カルノア固定液よりも重くなる） 2．低張処理が過剰（現 0.075 M KCl、37℃，10分）、または液を加え混合する際のピペッティングによる細胞膜の破壊 乱文で申し訳ありませんが、皆様のお力をお貸しください。
- ontheplanb
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私が言いたかったのは、低調液に完全に細胞を再懸濁した状態で （ピペッティングではなく指で軽くタッピングした後で） 少しずつカルノア液を入れていったほうがいいのでは？ ということです。 そして、カルノア液を徐々に入れるときも、少しずつ入れては軽くタッピングするとかした方が良いと思います。 低張液→白層（細胞層？）→カルノア固定液 これはゆっくり入れすぎてカルノア液が混ざっていないまま遠心したと思うからです。 ＞ピペッティング不足ではないかと助言をいただいたので試してみましたが効果はありませんでした。 こうありますが、私のアドバイスは、質問者様が上記のことを実行したときの他の方のアドバイズと同様に聞こえるかもしれません。 なので、一応聞いておきますが、 効果がなかったというのは、ピペッティングした後でも 低張液→白層（細胞層？）→カルノア固定液の三層となるのでしょうか？ もしそうでないのならば、懸濁とタッピングを試しても良いのではないかなぁと思います。
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- otx
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＞ピペッティングをたくさんしてみても三層になってしまいました・・ う～ん。それは明らかにカルノア液の層ができているということでしょうか？ もし、そうだとするとカルノア液の材料が変だと思います。 メタノールも酢酸も水と分離して層を作ることなんてないです。
- otx
- ベストアンサー率44% (256/576)
瀬戸武司 (1965) 両生類の骨髄細胞の染色体観察法 動物学雑誌 74; 234-244より 1. 大腿骨と脛骨に生理食塩水を流して、骨髄を集める 2. 生理食塩水にコルヒチン5μg/mLを加えた液で、室温2時間反応させる（カエルの場合） 3. 遠心 1000rpm 5min 4. 上清を捨てて水に懸濁する 20分 5. カルノア固定液を徐々に入れる カルノア液 酢酸：エタノール＝１：３（固定液の組成は基本的に同じ） 6. 遠心、細胞を集めて、固定液に再懸濁 7. もう一度、遠心、固定液に再懸濁 8. スライドガラスに播いて乾燥させる 9. ギムザ染色 20分 10. 水溶性封入剤で封入、観察 このような実験方法でしたら存じております。 私が思うのは、 ＞低張液に細胞が沈殿している状態でカルノア固定液を少量加え、 この細胞が沈殿しているままで固定液を入れるのがダメなのでは無いでしょうか？
補足
参考にしたプロトコルは理研のものであり、その他のプロトコルを見てみても、低張液に少量のカルノア固定液を加え、半固定する操作は多く記載されています。ですので、半固定の操作自体に間違いはないみたいなのですが・・・
- otx
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ちなみに、カルノア液の組成はどのようにしてらっしゃいますか？ 無水酢酸とか使っていませんよね？
補足
素早い回答ありがとうございます。 カルノア液の組成は メタノール：酢酸＝３：１ です。 酢酸の試薬ビンには酢酸とかいてあります。
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