ブロッティングについて

質問

現在、ウェスタンブロッティングを用いて実験を行っています。
皆様のご意見などを参考にさせて頂きたいと思い、投稿させていただきました。
以下の点について皆様のご意見をお聞かせ頂ければ幸いです。

ブロッティング時の電圧
当方では現在ブロッティングをATTO社のブロッティング装置を用いてセミドライ式で行っております。
ブロッティング条件は、「定電流150mA、時間60min、ゲルサイズ9cmx9cm」で行っております。
その際に電圧が、開始30V程から終了60V程まであがってしまいます。濾紙や膜は30分以上バッファーに浸けています。
これはやはり電圧が高すぎるでしょうか。
(参考書では定電圧で２５～３５Vとなっている為)

　原因として考えているのは、「装置に濾紙を重ねるさいに濾紙を持ち上げても水滴が
落ちないくらいまで水気をきり、重ねる際には特にバッファーをかけていないため濾紙の
水気をきり過ぎている」のではと考えています。皆さんはどの程度の電圧でされていますでしょうか。

長々と失礼いたしました。至らない文章でわかりにくいとは思いますが、よろしくお願い致します。

回答No.3

otx · ベストアンサー

＞開始30V程から終了60V程まであがってしまいます。

あのう、ブロッティング開始してすぐの電圧は30Vですよね？
それが時間が経つにつれて電圧が上がって終了時は60Vなんですよね？

ある程度電圧が上がるのは当たり前だと思います。
私のシステムでは２倍くらいに電圧が上がります。
問題はないですけど。

ブロッティング時間はどのくらいですか？
１時間くらいで通常は行うのですけど、
長いなら、そりゃ電流を維持するために電圧はあがりますよ。
（２時間までくらいが普通、でも個人的には長いと思います）

ウエスタンがうまくいっていないのでしょうか？
もし、そうでないのなら、別に許容しても良い範囲ではないでしょうか。

お礼

電圧の変化などが気になり今回質問させて頂きました。
ブロッティングは1時間で行っております。
なるほど、システムによっては2倍ぐらいの変化あるのですね。
転写などはうまくいっていいるようです。電圧も許容範囲というこのですので少し安心できました。どうもありがとうございました。

回答No.4

Mr_Spock

バッファーに通電すれば、分極が起こって抵抗が上昇するのは当たり前で、電気泳動の時だってそうでしょう。定電圧とか、定電流とか言うのは、電圧、電流のどちらのパラメータを一定に設定するかということで、他方のパラメータは抵抗値が変化するのに応じて変わります。中学理科で習ったはずのE=IR、抵抗が上がっていくならば、定電圧なら電流量が下がっていくし、定電流なら電圧は上がっていきます。逆に言えば、抵抗が変化しうる以上、電流、電圧の両方を一定には出来ないから、定電流と定電圧のオプションがあるわけです（定電力、つまり電圧値と電流値の積が一定というオプションのあるパワーサプライもありますけれど）。

補足

定電流での通電で電圧が上がっていくのは分かっていたのですが、定電流時における電圧がどの程度あがるものなのか具体的に分からず、もしかしたら定電圧時の電圧と同じくらいまでなのかなと思い質問させて頂きました。

わかりづらい文章で書いてしまい、申し訳ありませんでした。

回答No.2

SANSUI77

１．転写は巧くいっていますか？　濾紙やメンブレンがこげていませんか？
２．ブロッターはきれいですか？　塩が析出していませんか？　バネは全てきちんと働いていますか？
３．ゲルと濾紙、メンブレンの大きさは同じにしていますか？
４．きちんと空気は抜いていますか？

お礼

1,3,4については特に問題はなさそうです。電圧の変化などが気になり質問させて頂きました。指摘いただいた、ブロッターに少し塩みたいなのがついていましたので除去してみようと思います。どうもありがとうございました。

回答No.1

Dr_Hyper

実験はうまくいっているけど、電圧の変化が気になるということですか？
穿った見方をすれば、一応検出できているけども効率がわるいのではないか。もっとキレイに転写されるのではないかということでしょうか。
単純にはbufferが熱で蒸発してしまっているのかなと思いました。
もうすこしひたひたにしてトライされてみたらいかがですか？
転写効率は他の面でいろいろ方法はあります、メンブレンの種類とtransfer bufferの組成などが重要です。

お礼

おっしゃられる通り、電圧の変化や効率などが気になり質問させて頂きました。ひたひたにしたものとバンドのうつり方の比較や、transfer bufferの組成を見直してみようと思います。どうもありがとうございました。