- ベストアンサー
共免疫沈降でのfigure
geneticist12の回答
α××, α○○のαはanti-××抗体、anti-○○抗体を表します。 >IP,α××;Blot,α○○ anti-××抗体で免疫沈降(IP: ImmunoPrecipitation)させた沈殿をウェスタンブロットしてanti-○○抗体で検出した。 >Lysate;Blot,α○○ コントロールとして、IPに使ったLysateをIPせずにそのままウェスタンブロットしてanti-○○抗体で検出した。
関連するQ&A
- 免疫沈降法を用いた実験手法
2つのタンパク質(A,Bとする)が1つの複合体を形成していることを証明する場合 免疫沈降(anri-A抗体)→Western blot(anti-B抗体) という手法を用いますが、3つのタンパク質(A,B,C)が1つの複合体を形成しているのを証明する場合 免疫沈降(anti-A抗体)→cross link解除(95℃ 10分)→二度目の免疫沈降(anti-B抗体)→Western blot(anti-C抗体) という手法を行ったと論文で書かれておりました。この(95℃ 10分)という作業でanti-A抗体を変性させるにしても、目的とするタンパク質も一緒に変性してしまう可能性があるのではないでしょうか? もしこの手法が正しいのならば、95℃でタンパク質が変性しない理由も教えて下さい。
- ベストアンサー
- 生物学
- パルスチェイス・免疫沈降法について
論文を読んでいるのですが、パルスチェイス実験についてわからなくて困っています。酵母内での目的タンパク質(免疫沈降のためHAタグ付き)の発現量を見るために、パルスチェイスと免疫沈降を行っているようです。 論文を読んでわかる大まかなプロトコールは以下のようです (1)細胞をExpre35S35Sで10分パルス(35Sメチオニンと35Sシステインで標識) (2)20mMのメチオニンとシステインを含む培地でチェイス (3)細胞を破砕 (4)anti-HA抗体による免疫沈降 (5)SDS-PAGEとfluorographyで解析 とあります。 疑問点 ・パルスのあとに(2)の操作でメチオニンとシステインを添加するのは何 故でしょうか?チェイスという操作が具体的に何をするのか教えてい ただきたいです。 ・(5)の操作でSDS-PAGEを行うのは理解できるのですが、fluorographyで解析とはどういうことでしょうか?35Sを蛍光で見ているということなんですか? ・そもそも目的のタンパクを見るために、35Sで標識する必要があるの ですか?免疫沈降だけでは駄目なのでしょうか? 非常に困っているので、疑問点が一つでも解決して頂ける方はお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- このFigureの見方がわからなくて困っています。
【The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling】という論文(Nature)の中に相互作用の確認をIn vitro pull-down assayでおこなった実験の図があるのですが、どれとどれが相互作用しているかは理解できるんですが、METHODSを読んでも詳しい方法、SDS-PAGEの見方がわかりません。 図は2枚1組になっていて下段にInputとして[35S]でラベルした相互作用すると予想される片方のバンドが2本(2つのレーンで)見えています。←たぶんタンパク量が等しいことをいってるのだと思います。 上段の図は相互作用すると予想されるもう片方にMBPタグをつけたものと、MBPタグのみの2つのレーンがあり、相互作用すると予想される方のバンドが濃くなっています。 このことから2つのタンパク質が相互作用するというのは理解できるのですが、上下の泳動写真が同じもの(同じゲルを見ているもの)なのか、別々のものなのかがハッキリわかりません。 もし、同じ図をみているとしたら、[35S]でラベルされたものを【Phosporimager】で見たときに相互作用が確認されたレーンではMBPタグのみのレーンと比較して同じ濃さは理解できても同じ位置にバンドがくることはないですよね? ということはInputの図は[35S]でラベルされたものを等量用いたことを示すために、[35S]でラベルされたもののみを泳動したものと考えていいのですか? 言葉足らずな文章になってしまいましたが、詳しいかた、こういった図を見たことあるかたがいらっしゃいましたら早急に回答していただけると幸いです。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ウエスタンブロットは上手くいかないが免疫染色可能な場合
実験経験の浅い者です。初めて質問します。 細胞質、細胞膜上で発現しているあるタンパクに対する抗体を作成中です。既報にならって、合成ペプチドから抗体(血清)を作成しました。 目的の抗体ができているかを確かめるために、ELISA、ウエスタンブロット、免疫染色をしたのですが、ELSA、免疫染色は問題なく、ウエスタンブロットだけうまくバンドがでませんでした(非特異的なバンドのみ)。 発現しているはずの細胞を抗原としてβ-メルカプトエタノール、SDS入りのサンプルバッファーで溶解処理して、通常のSDS-PAGE、1次抗体は血清、2次抗体はWB用の抗体を使用しました。 免疫染色では、血清を2000倍希釈しても十分染色できました。 高次構造が変わると抗原性がなくなってしまうということなのでしょうか。 だとすると、ウエスタンブロットでは、還元剤なしにするとよいのでしょうか?何かよい方法はありますでしょうか。 よろしくお願い致します。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質相互作用を調べる
現在あるタンパク質についてどんなタンパク質と相互作用しているか(homodimerを含めて)を簡単に調べる方法を探しています。数個のものを調べるのなら論文を読めば済むのですが、100以上の蛋白質について調べようとしているためこの作業がかなり大変です。何かいいデータベースでもないでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- フィブロネクチン <免疫電気泳動>
フィブロネクチン<免疫電気泳動> 寒天板の穴に血清を入れ、電気泳動を行い、タンパク分離を行いましたました。 その後、穴を中心に泳動方向と平行な溝を上下に2つ作っていたので 上の溝に抗血清を入れ、下の溝に抗フィブロネクチンを入れて反応させました。 結果。。。 フィブロネクチンの沈降線がだいたいβ分画の位置にできました。 なぜ、この位置にできるのでしょうか? いろいろと調べていますが、なかなか理解できません。。。
- 締切済み
- 医療
- 架橋剤DSPについて
現在架橋剤(DSP)を用いてあるタンパクータンパク相互作用を検出しようとしているのですが、氷上でDSP stock(50mM in DMSO)をcell lysateに1mMになるよう加えると白濁し、全然溶けません。論文を見て試薬を調整しているので、濃度などが間違っている訳ではないと思うのですが、なにぶん論文だけを参考にしているので、何か間違っているのかもしれません。もし行ったことがある方がいれば、教えて下さい。
- 締切済み
- 生物学
お礼
早い回答ありがとうございます!! よく少ない情報で分かってくれました