【The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling】 ー 論文要約

前へ 次へ
このQ&Aのポイント
  • 【The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling】 is a Nature paper that discusses the confirmation of interactions using an In vitro pull-down assay.
  • The figure in question consists of two parts: the lower part shows bands representing the interaction between two proteins labeled with [35S], while the upper part shows bands representing the interaction between one of the proteins with an added MBP tag and the protein with only the MBP tag.
  • It is unclear whether the upper and lower parts of the figure are from the same gel or separate gels, and whether the bands in the lanes representing the confirmed interactions with [35S] would coincide with the lanes representing only the MBP tag in the same intensity.
回答を見る
  • ベストアンサー

このFigureの見方がわからなくて困っています。

【The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling】という論文(Nature)の中に相互作用の確認をIn vitro pull-down assayでおこなった実験の図があるのですが、どれとどれが相互作用しているかは理解できるんですが、METHODSを読んでも詳しい方法、SDS-PAGEの見方がわかりません。 図は２枚１組になっていて下段にInputとして[35S]でラベルした相互作用すると予想される片方のバンドが２本(２つのレーンで)見えています。←たぶんタンパク量が等しいことをいってるのだと思います。 上段の図は相互作用すると予想されるもう片方にMBPタグをつけたものと、MBPタグのみの２つのレーンがあり、相互作用すると予想される方のバンドが濃くなっています。 このことから２つのタンパク質が相互作用するというのは理解できるのですが、上下の泳動写真が同じもの(同じゲルを見ているもの)なのか、別々のものなのかがハッキリわかりません。 もし、同じ図をみているとしたら、[35S]でラベルされたものを【Phosporimager】で見たときに相互作用が確認されたレーンではMBPタグのみのレーンと比較して同じ濃さは理解できても同じ位置にバンドがくることはないですよね？ ということはInputの図は[35S]でラベルされたものを等量用いたことを示すために、[35S]でラベルされたもののみを泳動したものと考えていいのですか？ 言葉足らずな文章になってしまいましたが、詳しいかた、こういった図を見たことあるかたがいらっしゃいましたら早急に回答していただけると幸いです。 よろしくお願いします。

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • miya_0726
  • ベストアンサー率54% (94/173)
回答No.2

ざーっくりと読んでみました。 ご質問以外の部分は把握できているとして・・・。 Fig3f jai3-1変異株で発現が低下していた31遺伝子のプロモーター領域からコンセンサス配列を検索すると、赤字の遺伝子からMYC2が認識するT/G-BoxまたはG-Box配列が抽出された。 このことから、赤字の遺伝子はMYC2により直接発現制御されていると考えられる。 Fig5a JAZファミリー遺伝子（10個）自体は、MYC2欠損株で発現が下がり、MYC2の恒常発現株およびJasmonate刺激野生株で発現が上がる。 Fig5b これら10個のJAZファミリー遺伝子のプロモーター領域からコンセンサス配列を検索するとFig3fと同じくMYC2が認識するT/G-BoxまたはG-Box配列が抽出された。 Fig5c MYC2がT/G-BoxあるいはG-Box配列に結合するかどうかゲルシフトアッセイで調べた。JAI3遺伝子の上流にあるT/G-BoxまたはG-BoxにはMYC2が結合するが、Box部分をでたらめな配列に変えたものには結合しない。従って、JAI3遺伝子の発現はMYC2によって制御されている。 私はこの分野には詳しくないですが、言いたいことはSupplemental Figure 6（Figure S6）にあるとおりで、 ・通常はECF^COI1複合体とJAI3が結合し、さらにJAI3とMYC2が結合していて、MYC2結合サイトを持つ遺伝子は発現していない ・Jasmonate刺激が入ると不明な経路でシグナルが伝達し、JAI3はユビキチン化されて分解、フリーになったMYC2が関連遺伝子の発現を開始する。 ・発現する遺伝子の中にはJAI3も含まれており、そのうちJAI3がECF^COI1およびMYC2と結合しMYC2をトラップするため、MYC2関連遺伝子の発現が止まる。 こんなフィードバックループが存在するよ、ということみたいです。

biobiobio1
質問者

お礼

説明していただいてありがとうございます。 深く考えすぎて混乱してました。 コンセンサス配列を表しているFigはそのような配列がプロモーター領域にあったとういことを示しているだけなんですね。 文字の大きさの違いが割合なのか頻度なのかそこばかりに目がいってました。 Figure S6についてはa,bの図にあるフィードバックループの流れは理解できました。 ただ、JAI3ΔCがSCFCOI1によってユビキチン化されないことや、JAI3ΔCの存在がJAI3や他のJAZの分解を防ぐことはFig2やFigure S5で示されているのでわかるんですがAtMYC2の不活性化を維持している機構がイマイチ理解できていません。 JAI3ΔCを発現させることでSCFCOI1がJAI3ΔCと相互作用した状態でい続ける(JAI3ΔCが分解されない)ことで正常なJAI3やJAZをユビキチン化できず、そのC末で不活性化されているMYC2がはずらないことで転写が起きないと考えるのが普通なのですか？ それとも、もし最初にSCFCOI1のすべてがJAI3ΔCと相互作用せず、ごく一部が正常なJAI3やJAZと相互作用し、それがユビキチン化され、MYC2が動いたとしても、それはごくわずかであり、フリーになったSCFCOI1はいずれJAI3ΔCと相互作用することで本文中にあるように隔離され、MYC2もJAZsに抑えられたままという状態になる(機能したMYC2の影響はほとんどない)という考えになり前述と同じ結論になるんですか？ なにか考え違いや思い込みで理解している部分もあると思いますのでもしよければmiya_0726さんの理解されたこと、意見を聞かせてもらえたらありがたいです。 何度も聞いてすみません。

その他の回答 (3)

  • miya_0726
  • ベストアンサー率54% (94/173)
回答No.4

マイクロアレイについてはFig5a、Fig3e共にお考えの通りです。 35S-MYC2は恒常発現型のようですから、MYC2がJAZファミリーにトラップされようがどんどんフリーのMYC2が供給されるため、常にMYC2関連遺伝子は発現すると思います。 （そのうちJAZファミリー-MYC2複合体が溜まりすぎて破綻しそうな気もしますが、普通に生きているのですね） ですので、Jasmonate刺激とMYC2恒常発現は似た遺伝子発現パターンが見られますが、Fig5aより完全に同一というわけではないので、おそらくJasmonate刺激で動くシグナル経路は一つではないと考えられますね。At2g34600については別の制御機構がありそうです。

biobiobio1
質問者

お礼

回答ありがとうございます。 まだまだ勉強不足で理解に時間がかかってしまいましたがおかげさまでなんとか読めそうです。 もしかしたらまた質問する時があると思うのでその時はまた教えていただけるとありがたいです。 本当にありがとうございました。

  • miya_0726
  • ベストアンサー率54% (94/173)
回答No.3

コンセンサス配列のFigは、お考えの通り各ポジションにおける塩基の出現頻度を表わしています。厳密に保存されている部分とバリエーションがある部分が一目でわかるように、あのように表記することが多いです。 JAI3ΔCがAtMYC2の不活性化を維持している機構はお考えの通りでよいと思いますよ。どちらかというと後者がより適切ですね。 最初はJAI3ΔCを含め全てのJAZファミリーがECF^COI1と結合していて、ECF^COI1-JAZファミリー-AtMYC2およびECF^COI1-JAI3ΔCが共存しています。 JA刺激を受けるとJAZファミリーはユビキチン化を受けて分解されますが、JAI3ΔCはユビキチン化を受けないため、一度ECF^COI1と相互作用するともう外れません。 JAZファミリーが分解されフリーになったECF^COI1は、MYC2によって発現してきたJAZファミリーまたはJAI3ΔCと結合します。こうやってどんどんECF^COI1-JAI3ΔCが増えていき、MYC2はフリーのJAZファミリーと結合することで転写因子としての機能を果たせなくなり、Jasmonate非感受性になるのではないかと思います。 よーするにdominant negativeになってるってことですね。

biobiobio1
質問者

お礼

何度も回答していただきありがとうございます。 頭の中でだんだん整理できてきました。 あともう一つだけよろしいですか？？ マイクロアレイについては詳しくないので単純な理解しかしていないのですが、Fig5aの真ん中のものは、35S-MYC2なのでMYC2が恒常的に(過剰に)発現するようにしたものとWTとをJA処理せずに比較しているという理解でいいですか？ Fig3eの右も同じ条件(見ている遺伝子は違う)でいいんですか？ この場合、MYC2がWTと比較して多いの(フィードバックによって機能したMYC2が再びコンプレックスを形成してもJAZの分解ではなくMYC2恒常発現という形でフリーのMYC2が存在し続けること)でJA処理した時と同様に近い遺伝子の発現が上がるんですか？ また質問してしまいましたが教えていただけるとありがたいです。

  • miya_0726
  • ベストアンサー率54% (94/173)
回答No.1

論文見ました。 お察しの通り、別々に流しているはずです。 カラムに流すサンプル量と同じ量のサンプルを泳動してタンパク量が同一であることを示す、というよりはひとつのサンプルから同量を複数回とってもタンパク量の偏りはないですよ、ということを言いたいのだと思います。

biobiobio1
質問者

お礼

早速回答ありがとうございます。 やはりタンパク量が等しいことを示しているのですね。 助かりました。 過去のmiya_0726さんの回答から専門的な知識をお持ちの方だと察します。もしよろしければ同じ論文の【Fig3f】、【Fig5b】、【Fig5c】では何を表していてそこから何が考えられるのかがイマイチつかめないので教えていただけたら幸いです。

  1. カテゴリ
  2. 学問・教育
  3. 自然科学
  4. 生物学

関連するQ&A

  • SDS-PAGEゲルのトラブル

    あるタンパク質を生体物質から私の研究室（かなり小規模な研究室なので聞ける人があまりいないのです。）では精製していて、随分以前からそのタンパク質が精製できているかどうかをSDS-PAGEゲル上で確認していました。 ところが、ここ1ヶ月ほど前からそのSDSーPAGEゲルの電気泳動結果がおかしいのです。。 例えば、 *本来あるはずの低分子タンパク質のバンドが薄くしか（もしくは全く）見えない。高分子領域にスメアがたくさん見える。 *本来サンプルがアプライされているはずのないレーンにスメアっぽいバンドがたくさん見える。（特に高分子領域に） *バンドはかなりスメアっぽく見える。（シャープなバンドではない。） あと気づいたことですが、泳動直後のゲルはかなり暖かくなっていました。 このような原因として何が考えられるでしょうか？本当に困っています。 ちなみに、私たちの研究室では、 *SDS-PAGEゲルは自作 ポリアクリルアミド、SDS等を水溶液にしたものが冷蔵庫にストックされていて（2.3ヶ月前に作られました）、その水溶液と常時調製している10％APS溶液そしてTEMDを混ぜ合わせて常に作っています。 *ローディングバッファー 半年ちょっと前に作られて冷蔵庫にストックされたものを使っています。 *泳動用バッファー 10倍のTrisベースのバッファーが常温でストックされているので、それを随時希釈して使っています。 *泳動条件 150V（電気泳動ユニットに異常は見られません。）

  • タンパク質とリガンドの複合体形成、解離

    大学の講義で次の内容の課題をだされましたが、全くわかりません。この問題を解くヒントや、考え方のどこが間違っているのかを教えていただけると助かります。 問題 タンパク質と32Pで放射標識したDNAとを10分間混合後、電気泳動し、タンパク質（E)、DNA(S)の解離定数Ksを求めた。 K1=10^7M^-1s^-1　　　Ks=1pM(k-1=10^-5s^-1) =1nM(k-1=10^-2s^-1) =1μM(k-1=10^1s^-1) =1mM(k-1=10^4s^-1) それぞれの場合、タンパク質の濃度1mM、リガンドとしてのDNAの濃度1mMで10分間混合後、電気泳動を1時間行ったときの、電気泳動したレーン方向のDNAおよびタンパク質の分布をグラフにせよ。 この問題で、私はKs=1pMのとき、Ks=[E][S]/[ES]を利用して[ES]=10^6Mとなってしまいました。このとき、[E],[S]は1mMを利用して計算してきました。これだと、[ES]がタンパク質とリガンドの濃度を超えてしまっていておかしいと思うのですが、どこを考え直せばいいのかわかりません。[ES]が適切な値がでれば、[ES]=[ES]0×exp(-k-1×t)から、電気泳動開始t秒後に複合体として残っている濃度が求めれそうなんですが。電気泳動開始t秒後に複合体として残っている濃度の求め方はヒントとして与えられていました。 また、この問題ではグラフを書くのですが、どのようなグラフをかけばいいのかがわかりません。 ご指摘お願いします。

  • 電気泳動（SDS-PAGE）のタンパク質変性の原理？

    電気泳動（SDS-PAGE）で、タンパク質サンプルをＳＤＳと２－メルカプトエタノールで加熱処理すると、タンパク質のＳ－Ｓ結合が切れ、１本鎖になり、マイナスの電荷を帯びるために分子量に依存して分離されるという原理は理解しておりますが、その１本鎖分子が横状のまま流れるのと縦状で流れるのとでは、アクリルアミドゲルの網目構造での分子ふるい効果に影響がでると思います。 ようするに横状では泳動スピードが遅く、縦状では泳動スピードが速くなってしまうと想像しております。 この辺の原理を教えてください。よろしくお願いいたします。

  • cDNAについて

    あるタンパク質分解酵素を精製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動すると、60kDaのバンドが検出されました。このタンパク質にN末端と内部の部分アミノ酸配列を決定し、これに対応する合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、cDNAライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法により、全長のcDNAを単離しました。このcDNAは45kDaのタンパク質をコードしていました。 そこで、このcDNAが目的とするタンパク質分解酵素のcDNAであることは、どのような事実から示されるか。 また、このcDNAが確かに分子量60kDaのタンパク質のcDNAであるとすると、電気泳動で測定された60kDaとcDNAから予想される45kDaとの差異はどのような理由で説明されるでしょうか。 最後に、このタンパク質の生体内基質を同定するためには、どのような実験をすればよいか。 いろいろ考えたのですが、わからなかったので、よろしくお願い致します。

  • ウェスタンブロットの検出で

    題字の如くなのですが、HAタグをつけた融合タンパク質をサンプルに泳動後、ウェスタンブロットでanti-HA mouse IgGで検出するという実験を行いました。二次抗体はanti-mouse IgG HRP conjugatedです。 しかし、抗体処理後にアマシャム社のECLキットを用いて発色操作をしたところ、今まで何もなかったメンブレン上に茶色いバンドが出現しました。これは目的のタンパク質が多量に発現しているのだろうと思い、LAS-1000イメージアナライザーでバンドを検出しましたら、メンブレン上に見えていたバンドの位置に全くバンドが検出されませんでした。 怪しいところと言うと、抗体処理、あるいはブロッキングの段階が考えられますが、メンブレン上にバンドが見えるのに、それを読み取れなかったと言う経験をお持ちの方、いらっしゃいましたら考えられそうな原因を何でもいいので教えて下さい。お願いします。

  • 細胞小器官に存在するタンパク質の検索

    タンパク質データベースではタンパク質をどのオルガネラ局在であるかを条件に調べることが可能と理解しておりますが、その中でさらに 「ミトコンドリア内膜に局在する分子量13kDaのタンパク質」 などというように、細かい局在、または分子量からタンパク質を検索することは可能でしょうか？ また可能で、その方法をご存知の方がいらっしゃいましたらご教授願います。 具体的には、2次元電気泳動の後CBB染色したサンプルについて、検出したバンドがどのようなタンパク質かを調べたいのですが、文献をあたるのはなかなかに骨が折れそうなので質問しました。 文献をあたらないと無理なのかなとは覚悟はしているのですが・・・

  • 液体クロマトグラフィーについて

    　ある海綿動物の水溶液抽出液の透析内液(排斥限界分子量１万）から、ヒトの免疫能力を高める作用をもつ物質を精製し、部分精製標品を得た。この画分をSDS電気泳動に供したところ、４種類のタンパク質性バンドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄが検出された。この内ＡとＣはPAS染色に陽性で糖タンパク質であることが分かった。一方、等電点電気泳動では、３種類のバンド(PI4.2、5.6、8.2）が検出された。そこで、液体クロマトグラフィーを用いて、この部分精製画分中の４種類の成分をそれぞれ単離することにした。どのような精製法を用いればよいだろうか。というレポートが出されました。私は、このような実験をしたこともなく、どういった解答をすればよいかも分かりません。誰か解き方だけでも教えてください。お願いします

  • 生化学系論文の和訳の添削　その１２

    QNo.7130057の続きです．今回は，これまで頂いたアドバイスを私なりに解釈して，自然な訳にもチャレンジしました．誤訳していないか，お気づきの点があればアドバイスをお願いします． (1)The amounts of proteins synthesized in microreactor array chip were compared with that in a test tube with RTS 500 using SDS-PAGE electrophoresis following Western blotting as shown in Fig. 3. (1)マイクロリアクターアレーチップ中で合成された蛋白質の総計（総量）は図３に示したように，以下に示すSDA-PAGEを使用したPARTS500電気泳動による試験管試験と比較された． 自然な訳：マイクロリアクターアレーチップ中で合成した蛋白質の総量について，SDA-PAGE（以下に示す）を使用したPARTS500電気泳動による試験管試験と比較した． (2)An RTS 500 reaction was performed without template DNA to obtain E. coli lysate background (Lane 1). (2)RST500の反応の一つは，大腸菌溶解物の予備知識を得るために鋳型DNAなしに行われた． 自然な訳：大腸菌溶解物の予備知識を（基礎データ）を得るためにRST500で鋳型DNAなしに合成した． (3)Three immunoreactive bands with respective molecular masses of 15, 17, and 38 kDa are observed at the same position using the RTS 500 (Lane 2) and using a microreactor array 　chip (Lane 3). (3)15，17および38ｋDaの３つの分子量の免疫反応バンドは，いずれもRTS500を使った場合（レーン２）とマイクロリアクターアレーを使った場合（レーン３）と同じ位置に観察された． 自然な訳：３つの免疫反応のバンド（分子量：15,17,38ｋDa）は，いずれもRTS500を使った場合（レーン２）とマイクロリアクターアレーを使った場合（レーン３）とで同じ位置に観察された． (4)Because the bands of 20 and 45 kDa are observed even in the absence of the expression DNA, as shown in Lane 1, those bands seem to represent the other proteins contained in the E. coli lysate. (4)レーン１に示したように20および45ｋDaのバンドは遺伝子不在の中でさえ観察されるので，これらのバンドは大腸菌中に含まれている他の蛋白質を意味するように思える． 自然な訳：レーン１は鋳型DNAなし（遺伝子不在）の結果である．20および45ｋDaのバンドは大腸菌由来の他の蛋白質と考えられる． (5)In the A-FABP synthesis, the band of 20 kDa in Lane 3 is very weak compared to those of the other lanes. (5)A-FABPの合成において，レーン３中の20 kDaのバンドは他のレーンのそれらに比べ非常に弱い． (6)We surmised that such weakness is attributable to the chemophysical adsorption of the protein of 20 kDa onto the inner surfacess of flow channel and reaction chamber in the microreactor array chip, so that some protein has a large affinity against the PDMS material in our experiment. (6)我々の実験において、蛋白質は，PDMS材料に対しておおきな親和力を有するので，このような（バンドの）弱さは流路およびマイクロリアクターチップの反応室内側の表面への20kDaの蛋白質の吸着化学物理吸着作用によるものであると推測した． 自然な訳：本実験において使用したPDMSは蛋白質と親和力がある．20ｋDaのバンド強度が弱くなっているのはマイクロリアクターチップ内部への吸着作用によるもとのと考えられる． (7)The band, which appeared at expected molecular mass of 15 kDa, shows that AFABP was synthesized. (7)このバンド，そしてそれ（期待される15kDaのモル質量として現れたものである）は，AFABPが合成されたことを示す． 自然な訳：15ｋDaのバンドはAFABPが合成されたことを示す． (8)Similarly, the band at 17 kDa corresponding to cyclophilin and the one at 38 kDa corresponding to G3PDH show that they were also synthesized. (8)同様に，17kDaのバンドはサイクロフィンと一致し，また38kDaのバンドは，G3PDHと一致しており合成されたこと示す． 自然な訳：17kDaおよび38kDaのバンドは，それぞれサイクロフィンおよびG3PDHと一致しておりこれらが合成されたこと示す．

  • タンパクの精製について質問があります。

    タンパクの精製について質問があります。 GSTタグ融合タンパク質をG-sephaで精製しているのですが、樹脂から溶出されなくて困っています。 タグはThrombinで切り離して、Thrombin処理後にbufferで溶出しています。 bufferには100mM程度の塩が加えられているのですが、どうも樹脂に絡まって出てこないという状況 なので、思い切って500mM～1Mの範囲で、条件を検討してみようかと思っています。 塩濃度を上げすぎるとタンパクに良くない（変性する）などの問題が出てくるでしょうか。 また、1Mの塩が入っているbufferで溶出しても後に透析などで塩を除けば大丈夫なものなのでしょうか。 また、塩で溶出した場合、Thrombinで切断されずに残ったGST融合タンパクがタグ付きで出て来てしまう、切断はされたものの、GSTタグだけのものもG-sephaとの相互作用が弱くなって出てきてしまう、などのトラブルはありえますか。 素人なので良くわかりません。 どなたか経験者の方、ご教授よろしくお願いします。

  • 制限酵素によるプラスミドの切断

    生物学の実験で、制限酵素によるプラスミドの切断の実験を行いました。制限酵素で二重鎖DNAを切断し、生じたDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離するという方法です。 コントロール・・・・（プラスミド　蒸留水　High Salt Buffer Medium Salt Buffer) サンプル・・・（コントロールにEcoRI　HindIIIの制限酵素を加えたもの）の２つをそれぞれをゲルに流し込み。電気泳動を行いました。 電気泳動後、ゲルの写真を見たのですが C　 ｜ ｜ 　　 S ｜｜｜ 　 －　→泳動方向→　　　　　＋ というような結果が出ました。　 サンプルとコントロールのバンドの距離が同じ長さなので、切断されていないと先生が言いました。ここから質問なのですが、 切断されていないということは、サンプルのレーンのバンドの数は０本ということですか？ また、なぜ切断されなかったのか教えてください（制限酵素によってDNAが切断されたのなら、そのDNAにはその制限酵素の認識配列が含まれいたということですよね。私たちの班のDNAには認識配列が含まれていなかったことになるのでしょうか？）

注目のQ&A

カテゴリ

専門家に質問してみよう

職業から探して質問する

あなたにピッタリな商品が見つかる！ OKWAVEセレクト

質問する