アミノ酸置換と発現量の関係

質問

今回、あるタンパク質のAlaをLeuに置換した
変異体を作ったのですが、発現量が野生型の2倍以上になりました。

変異体作りは初めてだったので、
そのメカニズムとか調べてみたのですが分かりません。

どなたかご存知の方いらっしゃいましたら、
ご回答の程、よろしくお願いいたします。

回答No.3

miya_0726 · ベストアンサー

あ、やはりBL21(DE3)にpETシステムでしたか。

大腸菌のコドンで、どれをレアコドンとするかは諸説ありまた基準もいろいろあるのですが、

http://www.cosmobio.co.jp/support/technical/tech_NVG_20040518/tech_NVG-5-B_20040518.asp

例えば、コスモバイオではArgコドンのAGA、AGG、CGG、CGA、IleコドンのAUA、LeuコドンのCUA、GlyコドンのGGA、ProコドンのCCCをレアコドンと定義しています。大腸菌については、これらをレアコドンとする場合が多いようです。
Leu(CUG)は最大多数コドンなので、AlaがLeu(CUG)に変わることで発現量が上がる可能性はありえる話だと思います。

個人的には、レアコドンで発現量が変わるのはレアコドンクラスターが形成されてしまう場合に限るのではないか、と思うので、やはり別の要因があるような気がします。

お礼

ありがとうございました。

賜りました沢山のアドバイスを参考に、考察を練っていきたいと思います。

本当にありがとうございました！！

回答No.2

miya_0726

DH5αですとAlaはどのコドンもレアコドンではないですね。
BL21を使用していないようですので、OmpTかLonの影響を疑ってみましたが、OmpTはあまり関係なさそうです。Lonは、Alaが絡むcleavage siteがありますが、逆にLeuが絡むようなCleavage siteもあるのでなんともいえません。
対プラスミド変異キットを使用していて、DH5αで発現が見えているということは、pETシステムではなさそうですね。pUC系かlacプロモーター入りのlow copy plasmidあたりでしょうか。発現プラスミドの、変異導入箇所以外（特にプロモーター周辺）に変異が入っていないことは確認されましたか？

導入変異点以外は「すべて」同一の条件で比較されているということが担保できるのであれば、置換によりタンパク質の立体構造が変化し、分解されにくくなったというのが一番近いような気がします。

回答になっておらずすみません・・・。

お礼

ありがとうございます。非常に参考になりました。これからNMR測定をしますので、立体構造の安定化については、これから検討してみようと思います。

ただ、本当に申し訳ないのですが勘違いをしていました。

ホストはBL21 DE3ですし、pET15bを使用しています。なお、変異導入箇所以外に変異が入っているかどうかについては、まだ確認していないので、これから確認してみようと思います。

また、アミノ酸を変えるという意味ではAla→Leuのみですが、Leuの直ぐ後ろに、変異導入の確認のための制限酵素サイトも導入しています。そのため、アミノ酸配列は Leu Thr Ser ですが、Thr Ser も野生型とは異なるコドンに置換しています。

ちなみにそれ以外の、発現、精製の条件は全て同じです。

ご親切に御回答くださっているのに、説明不足で本当に申し訳ございません。

また、レアコドンという言葉を先程初めて聞いたのですが、（忘れただけの可能性もありますが）先程、御示唆を頂いてから下記のサイトにて調べてみました。

http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=413997

この中では、どの程度のものをレアコドンと呼ぶのでしょう？

また、コドンユーセージが高いアミノ酸に置換したことによって、発現量が向上するということは考えられないのでしょうか？（LeuはCTGを使用しています。）

長々とつまらない質問で申し訳ございませんが、ご回答いただけると助かります。

回答No.1

miya_0726

どのようなバックグラウンドかわからないのでなんとも言えませんが、例えば
・Alaをコードするコドンがレアコドンだった。Leuをコードするコドンがレアコドンではなくなったため翻訳時の律速が解除され、翻訳量が向上
・Leuに変更することでタンパクの立体構造が安定化し、分解されにくくなったため見かけの発現量が向上
・コドンを変えることでmRNAがとる二次構造が変わり、安定化した
など、いろいろ考えられます。

(1)どの生物で、(2)どの遺伝子を、(3)どのような手法で置換したのか、それがわからないと考えにくいです。

お礼

早速のご回答ありがとうございます。
遺伝子に関しては初心者なので非常に参考になりました。

質問をさせて頂く側にも関わらず、説明が足りず申し訳ございません。
ご指摘があった部分の補足をさせて頂きますと、

(1)大腸菌DH5α株

(2)放線菌の抗腫瘍活性のある分泌タンパクをコードする遺伝子です。置換したAlaは基質との接合部分にあります。

(3)StratageneのQuikchange Mutagenesis Kitを用いてプラスミドごと増幅して変異を導入しています。

以上のような補足でも不十分かもしれませんが、
更なる御考察を賜われたら幸いです。
よろしくお願いたします。