平滑化：klenowかT4DNA polymeraseか

質問

• 平滑化において、klenowとT4DNA polymeraseの選択について疑問があります。
• 疑問としては、なぜ教科書にはクレノーの例ばかりなのか、T4DNA polymeraseが選ばれない理由は何か、そしてクレノーを用いた平滑化のメリットとデメリットについて知りたいです。
• 複数の業者への問い合わせ結果によれば、クレノーは１塩基されるため平滑化には不向きであり、T4DNA polymeraseを使用するように回答がありました。しかし、T4DNA polymeraseの強力なエキソヌクレアーゼを考慮すると、なぜクレノーの方が第一選択なのか疑問です。

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

まあ用途（polish活性も必要かなど）と用法が間違っていなければどちらを使ってもちゃんと出来るんですけれど。Klenowがfirst choiceになっている成書が多いのはどうしてかという質問に答えるなら、前期のような回答になります。

＞↑これですが、失活させるには激しいボルテックスを行う、と説明書にありますが、

説明書にあるならそれでもいいのでしょうけれど、あまり一般的とは言えませんね。フェノールをぶち込んで反応を止めろというのは確かTakaraのkitがそうなっていたと思います。加熱（70℃前後）で止めるというのも割と一般的なようですが、先に書いたようにフェノールが安全だと思います。

＞↑温度を下げた場合、T４およびクレノーの反応時間は何分位でしょうか。またdNTPは、標準でもかなり濃いですが、更に２倍３倍入れるという事ですか。入れすぎて問題は無いのでしょうが、どれくらい入れたら良いのでしょうか。

Molecular Cloningによると、T4は100 uM dNTP, 12℃, 15 min、Klenowは50 uM dNTP, r.t., 15 minです。

通常の実験スケールだと酵素過剰になって失敗することが多いので注意です。5 ug以下のDNA量なら通常1 unitもあれば十分です（キットを使うと少量のDNAには酵素が多すぎる場合がある）。DNA量に対して酵素量が多い場合は反応時間はもっと短くていいかもしれません。
Taq polなどと違って、dNTPの濃度は高すぎても問題ないと思います。
ただ、上記の濃度は上記の反応条件の場合ならということで、たとえば反応時間を延ばしたりすると、dNTPがどんどんdNMPに分解されて濃度が下がってきて、削れこみ反応がおこりやすくなる可能性はあります。

＞１個人の、１研究室の意見より、メーカーの答えは遥かに信用出来ると思われるんですけどねえ。。

＞＞これは、いろいろな成書の記載や、経験上からも非常に疑問がある見解だと思います。

と書いたように、決して一個人の意見というのではなく、数々の成書や参考文献から学び、実際にやってみてきたことです。

メーカーの情報も役立ちますが、ちゃんと根拠になる文献がトレースできる実験書（たとえばMolecular Cloning）をそばに置いておくことをおすすめします。

先にも書いたように、Klenowに一塩基付加の活性があるという文献はあります。しかし、だからbluntingにはKenowよりT4 polのほうが優れているということを実際比べてみているわけでもないし、結論わけでもないです。なのにメーカーがそういうことを言っているというのがうさんくさいと思うわけで。

お礼

おはようございます、度々の丁寧な回答ありがとうございました。
当初の質問とその後の質問に対して、当方が知りたかった点について、完全な回答を得られたと思います。ありがとうございました。
また一部失礼な文章がありましたが、それにも関わらず真摯なお返事を頂けた事、大変感謝しております。ただ、決して非難・反論する意図では無かった事を再度記載させて頂きます。
それでは改めて、ありがとうございました。またお礼が遅れました事、申し訳ありませんでした。また何かありましたら、宜しくお願い致します。