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平滑化：klenowかT4DNA polymeraseか
geneticist12の回答
- geneticist12
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3'突出末端を削って平滑化する場合（polish-up）は、3'->5'exonuclease活性の強いT4 polを使います。Klenowはpolymerase活性に比べるとexonuclease活性は非常に弱いので不向きです（大量のklenowを使えば実用上全く不可能というわけではない）。 3'陥没末端を伸長して平滑化する場合（Fill-in）のときは、T4 pol,Klenowどちらも使えます。 しかし、T4 polはexonuclease活性が強いので、条件によっては伸長反応より削り込み反応のほうが優位になります。結果として、3'末端を削り込み陥没末端にしてしまうため、平滑化に失敗します。（もうひとつ付け加えると、T4は平滑化された末端からはexoで削ろうとします。末端を削っては埋めるという反応が絶えず繰り返され平衡しているというのがT4 polの平滑化です。平滑化された状態で反応が終了するKlenowより結果が不安定ということは言えます）。 これを防ぐには、T4 polを過剰に入れない、反応温度を下げる（12℃位まで下げてやると、exonuclease活性よりpolymerase活性のほうが優位になります）、dNTPを濃いめに入れる、反応後の不活性化を速やかにかつ十分におこなうことが必要です（Molecular Cloning参照）。市販のキットによっては反応温度を37℃にしているものもありますが、そのとおりにやると失敗することが多いです。 私は、Fill-inのときはKlenow（これも37度ではなく室温で反応させるのが安全）、Polish-upのときはT4 polというように使い分けています。 ＞クレノーはfill inと同時に１塩基される為不向きなので、T4DNA polymeraseを用いて下さいとの回答でした。 これは？？？？？
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お礼
早速のお返事ありがとうございます。 ＞クレノーはfill inと同時に１塩基される為不向きなので、T4DNA polymeraseを用いて下さいとの回答でした。 これは？？？？？ ↑ すみません、言葉が切れていました。「１塩基付加される為」です。 以下はメーカーの記載です。 http://www.promega.co.jp/Cre_Html.php?pGMPID=0203001 http://bio.takara.co.jp/catalog/qa.asp?ID=13&c_id=C0150