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平滑化：klenowかT4DNA polymeraseか
geneticist12の回答
- geneticist12
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>すみません、言葉が切れていました。「１塩基付加される為」です。 これは、いろいろな成書の記載や、経験上からも非常に疑問がある見解だと思います。 たしかに、T社が挙げている参考論文にはKlenowに一塩基付加の活性があることを示していますが、一般的にpolymeraseが一塩基付加をするは普通ですし（proof reading活性がある場合はその頻度が下がるだけ）、Klenowで一塩基付加されるDNA分子はのフラクションは全体としては少数派ですしね。参考論文でも、それがBlunt end ligationに著しく影響を与えるとも、T4 polの削れ込みによる悪影響よりましということも言っていないようですし。P本社でもKlenowよりT4を使うほうがよいということは言っていないみたいですし。 http://www.promega.com/guides/subcloning_guide/_row/default_row.htm T社のT4 polを使った高価なblunting kitを売っていますから、もっともそうなことを言っているのではないかとかんぐりたくなります（このkit、失敗することが多く私の身の回りでは評判が良くないです）。 Klenowは反応バッファーを選ばず、DNAの純度が低くても活性が落ちませんので、制限酵素消化してそのままbluntingに移しても十分ですし、反応後は熱変性で不活性化できます。使いやすく失敗がすくないです。 T4は反応条件の影響を強く受けますし、失活させるのも熱失活は削れ込みを増進する可能性があり、安全のためには常温でフェノール抽出する必要があるなど面倒があります。 ということで、fill-inでbluntingできるときは失敗の起こりにくいKlenow使用を薦める成書が多いのはうなづけます。
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お礼
おはようございます。経験的に、Klenowが良いという事でしょうか。 別に僕は業者の回し者でも何でも無いですが、プロメガ、タカラ、ニッポンジーンに問い合わせた所、全て同様の回答を得ました。即ち、T４を薦める。理由は１塩基付加による非効率、等々です。 商品化に当たっては膨大な実験が再三行われていると思われるので、１個人の、１研究室の意見より、メーカーの答えは遥かに信用出来ると思われるんですけどねえ。。 誤解して欲しくないのですが、批判しているのでは無いです。何が言いたいかと言うと、僕は生化学の実験を始めて今だ日が浅いのですが、今回に限らずなにがしかを選ぶ時、では何を信じたら良いのか？失敗した場合、原因をどのように解釈したら良いのか？どうしたら良いんでしょうかね。 それは経験を積む事かも知れないですが、そんな、いちいち体で覚えていたら身が持ちません。時間も足らないです。ちょっと愚痴っぽくなってしまいました。
補足
すみません、幾つか教えてください。 ・T4は反応条件の影響を強く受けますし、失活させるのも熱失活は削れ込みを増進する可能性があり、安全のためには常温でフェノール抽出する必要があるなど面倒があります。 ↑これですが、失活させるには激しいボルテックスを行う、と説明書にありますが、それでは駄目なんでしょうか。 またライゲーションを目的とする場合カラム精製を行いますが、T4を完全に除去出来ないのでしょうか。 ・T4 polを過剰に入れない、反応温度を下げる（12℃位まで下げてやると、exonuclease活性よりpolymerase活性のほうが優位になります）、dNTPを濃いめに入れる、反応後の不活性化を速やかにかつ十分におこなうことが必要です（Molecular Cloning参照）。市販のキットによっては反応温度を37℃にしているものもありますが、そのとおりにやると失敗することが多いです。 ↑温度を下げた場合、T４およびクレノーの反応時間は何分位でしょうか。またdNTPは、標準でもかなり濃いですが、更に２倍３倍入れるという事ですか。入れすぎて問題は無いのでしょうが、どれくらい入れたら良いのでしょうか。 以上よろしくお願いします。