平滑化後のligationについて

質問

T4polymeraseで平滑化したインサートってリン酸基がついているのでしょうか？
平滑化したインサートと、平滑化し、SAPで脱リン酸化したベクターでライゲーションしたのですがコロニーが全く生えてきませんでした。
なにか一般的につまづくようなところと解決法などありましたら教えてくださいませ。

回答No.2

Mr_Spock · ベストアンサー

T4 DNA polで末端のリン酸基がはずされる反応はありません。

T4 polで平滑化するのは簡単そうな反応ですが、じつは非常にトリッキーです。T4 polは3' exonuclease活性を持ち、3'突出末端を削る平滑化もできますが、活性が強いので二本鎖部分でも容易に3'末端を削り込んで陥没させるので、平滑化の失敗が起こりがちです。

酵素量を下げる、反応温度を下げる、反応時間を短くする、反応後の失活を速やかに行う（高温で失活させようとすると、失活する前に高温で削れこみが促進する可能性があるので、フェノール抽出がよい）などでコントロールします。

お礼

コロニー数は少なかったですが無事クローニングできました。
ありがとうございました。

回答No.1

samkuma

通常のPCR産物はリン酸化されていません。

プライマーを設計する際にリン酸化してくれるサービスがあります。
それか，T4 Polynucleotide Kinaseでプライマーをリン酸化するか，産物をリン酸化してからLigationすればOKです。

これは個人的な感覚ですが，平滑の場合もベクターを脱リン酸化せずにLigationしても問題なく入ります。その代わりコロニーを16個くらいつつきますけど。。。

お礼

なんとかクローニングできました。
ありがとうございました。