クローニング

質問

組み換えDNA、コンストラクトの作製を行っています。制限酵素処理後、ライゲーションハイを使ったライゲーション、トランスフォームの順に行っているのですが、コロニーが得られません。インサートの入っていないプラスミドを用いたコントロールはきちんと生えます。
ライゲーションの際に用いるDNAの濃度はどのくらいが適当なのでしょうか？濃いほうがいいのでしょうか？
また、トランスフォームはDNA量が10ng以上だと効率が落ちると聞いたので、ベクターとインサート合わせて10ng以下になるようにしているのですが、逆に濃いほうがいいのでしょうか？
何かアドバイス等ありましたらお願いします。

回答No.3

alice_with_tak

ベクター：インサート比はその相性によって変わってきますが基本的にはインサートの比率が大きいほうがライゲーション効率は上がります。ベクター：インサート比が1：10以上でやったことがありますが1：1に比べ効率は非常によくなりました。
トランスフォームに関してはDNA量が多いほうが効率は上がります。ただし例外があり、最近のライゲーションキットにはBuffer中にPEG（ポリエチレングリコール）が含まれているものがあります。これは溶液中の水分を奪い、ベクターとインサートDNAが出会う確立を高くすることにより短時間でライゲーションができるようにするために入っているのですが、このPEGはトランスフォームにおいては阻害剤となるため、ライゲーション溶液をそのままトランスフォームに用いる場合、コンピテントセル溶液に対しライゲーション溶液の比率が大きくなるとうまくないみたいです。だいたいライゲーション溶液1に対しコンピテントセル溶液10以上となるようにしなければならないようです。もしくはいったんエタ沈などでライゲーション溶液を精製をするとよいです。
あとはcfuが等しくてもコンピテントセルによって効率が変わるようです。DH5αは比較的大きいプラスミドベクターでも入りやすいのでいったんそれにトランスフォームし、増やしてあと、アルカリプレップでベクターを回収し目的のセルに再度トランスフォームするのも手です。
あとはLigaseの失活とか制限酵素の失活とかですかね

回答No.2

mizu_atsu

濃度をどのくらいにするかというのは資料が手元に今ないのでわかりませんが、
ベクター：インサート=1：2～10くらいでやっていました。
やけに幅が広いと感じるかもしれませんが
それはインサートの大きさが違うからです。
インサートが大きい場合は入る確率が低いので高めにする必要があるからです。
2kb位なら2～4倍くらいで良いと思います。
それより大きい場合はもっと増やした方がいいでしょう。

とりあえず問題の切り分けが必要ですね。
形質転換自体はできているようなので大丈夫ですが
ライゲーションができていない可能性があります。
♯1さんが言っておられるようにベクターのみ（アルカリフォスファターゼ処理していない切っただけのもの）でセルフライゲーションさせる形質転換できるかどうかみたほうがよいでしょう。
それでできれば操作に問題はなくサンプルに問題がある可能性が高いです。
サンプルが汚染されていたり、大きすぎる断片だったりする、ということです。

その結果を見て
サンプルを作り直す、トランスフォーメーション操作を変える（エレクトロポレーションにする）、市販のハイコンピンテントセルを使うなどの措置をとることになるでしょう。

回答No.1

Dr_Hyper

ヒトによって流儀が有るとは思いますが、私はベクター１０ngに対し、insertはモル比で4-8倍量をいれてligationしています。vector 4kbp 10 ngにinsert 1kbpであれば10 ngです。2kbpであれば20ngとなります。確かにDNAを入れすぎるとtransformation効率は低下しますが、ちゃんとplasmidになった（ligationされて環状になったもの）がある程度なければコロニーも生えないので、全体で200ngを超えないのであれば気にしないで十分量でligationすれば大丈夫です。ただ、ベクター量が10ngをこえると、insertの入っていないバックグラウンドが非常に増えますので、通常はベクターを10-30ng程度にしてliagtionすればいいと思います。ただ、この濃度もヒトによって概算の仕方がことなりますので、insertをいれずにベクターのみをligationしたサンプルもコントロールとして平行に実験し、insertを入れた方がコロニーが増えることを確認して下さい。このときコントロールのコロニーがかなり多い場合には、ベクターを入れすぎていると考えていいと思います。