抗生物質について

質問

大腸菌の培養に使うLB培地に抗生物質（アンピシリン、カナマイシン）を入れますが、
もし入れなければ耐性を持っていない大腸菌が無造作に増えるわけですよね？その大腸菌からプラスミドを抽出したらどうなりますか？

実験にならないことは間違いないでしょうが。

抗生物質を溶かす時は普通のMilliQでいいんですか？
滅菌水をさらに濾過滅菌まで行うと必要はあるんですか？
皆さんはどうやっていますか？

また、カナマイシンはアンピシリンに比べて溶解度が低いんですか？

保存は-30℃で保存しますが、室温で置いておくと駄目になるからですか？
2日室温に置いていた物はもう使えないですかね。

回答No.5

MIYD · ベストアンサー

>#4さん
ご回答ありがとうございます。
通常のコンピタントセルにはそんなプラスミドも入っているんですね。

>質問者さん
70%エタノール溶液を入れる量は、
1/500~1/1000Vol.位になると思います。
この濃度では大腸菌の生育に影響は見られません。
また、MilliQで冷凍庫保存ということは、
毎回溶かしてから使っていますよね。
70%エタノールはこの温度では凍りませんので、
溶かさずにすぐに使えるという利点があります。

回答No.4

mojal25

#3さん
>>#1さん
>>薬剤耐性因子を持っていないプラスミドが取れます。
>それは特殊なプラスミドなのでしょうか？
>プラスミドが増えてこないのは見たことがありますが、
>リコンビネーションか何かで一部がdeletionして、
>それが回収されるという意味でしょうか。

#1さんではないですが・・・
プラスミド回収では遺伝子導入プラスミドに加え、大腸菌が元来持っている種々のプラスミドDNAが回収されます。
今回の話では、薬剤耐性をもつ大腸菌コロニーを選ぶ可能性が非常に
低いと考えられるため（遺伝子の導入効率が低いことによる）、
PCRで目的のインサートを増幅させるのはとても困難であると思われます。

あとは、質問者さんへの回答ということで。

>抗生物質を溶かす時は普通のMilliQでいいんですか？
OKです。
ただし、抗生物質を溶解させた後のフィルトレーションは必須です。

>カナマイシンはアンピシリンに比べて溶解度が低いんですか？
すみません、分かりません。
でもなぜそのような疑問が？

>保存は-30℃で保存しますが、室温で置いておくと駄目になるからですか？
>2日室温に置いていた物はもう使えないですかね。

当方も高濃度（5mg/ml）でストックを作製し、冷凍保存しています。
しかしLBプレートに関しては、アンピシリンを塗った後室温で保存
してますね。1週間保存したプレートでも問題なく薬剤セレクションできます。

回答No.3

MIYD

収量が非常に減ります。

抗生物質を溶かすときは、
それぞれの抗生物質にあった溶媒を使っています。
私は操作が簡便になるので、
アンピシリンには70%エタノールを使っています。

その抗生物質に耐性の菌がコンタミしていた場合、
増殖してしまうので、
MilliQで溶かしたものはフィルター滅菌しています。

>保存は-30℃でしますが‥
しませんが‥、というかそれは質問者さんの聞いたプロトコロルであって、
それを作成したときの状況から選んだのが理由だと思います。
とりあえず、室温で1月で50~70%位に失活したと思いますが、
どこに欠いてあったのか思い出せません。

>#1さん
>薬剤耐性因子を持っていないプラスミドが取れます。
それは特殊なプラスミドなのでしょうか？
プラスミドが増えてこないのは見たことがありますが、
リコンビネーションか何かで一部がdeletionして、
それが回収されるという意味でしょうか。

お礼

御回答有り難うございます。
収量が減るとは必要なプラスミドのですか？

確かに水にamp耐性菌が付いていると困りますね。
抗生物質なしの培地に大腸菌を入れると
全ての大腸菌が増えるとともに雑菌も増えるわけですね。

エタノールは殺菌用に使いますが、
大腸菌を培養する時、死亡したりしませんか？
ampで不要な大腸菌は死にますが、
エタノールでamp耐性の大腸菌も死にそうですが。

回答No.2

yakyutuku

生存に不要なプラスミドが、脱落することが予想されます。真核は細胞質の増幅が分裂律速になるのに比べ、原核は核酸の複製が分裂律速になります。

お礼

御回答有り難うございます。
抗生物質を使う理由はコンタミを防ぐ、プラスミドを保持する目的があるんでしたね。プラスミドが脱落が困りますね。
逆に言えばプラスミドの収量が減っていなければ問題ないということですか。

回答No.1

nayu-nayu

＞その大腸菌からプラスミドを抽出したらどうなりますか？
薬剤耐性因子を持っていないプラスミドが取れます。
質問者さんは、こうして得たプラスミドに薬剤耐性遺伝子を組み込んだのではないでしょうか。

＞抗生物質を溶かす時は普通のMilliQでいいんですか？

滅菌水に溶かし、更に濾過滅菌しました。
MilliQや抗生物質に元から薬剤耐性因子を持った菌が付着していたんじゃないか？　という可能性を排除したかったので。