- ベストアンサー
タンパク抽出
酵母からタンパク質を抽出する方法を教えてください。ちなみに、発現量を見たいだけなので、変性とかはしてもかまいません。
- みんなの回答 （3）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
その他の回答 (2)
- narupon
- ベストアンサー率38% (38/100)
＃２です。 どちらか一方で大丈夫です。 大抵は超音波で破砕します。 １：培養後、適当なバッファーor生理食塩水で洗浄（培地成分・細胞外発現タンパクなどの夾雑物を取り除くため）。 ２：バッファー等に懸濁し、超音波破砕。 ３：最初白濁状態だったものが、だんだん透明＆ドロドロになってきたらちゃんと破砕されている証拠。終了。 （注意）氷冷しながら操作してください。超音波破砕操作で温度も上昇しますし、常温などではプロテアーゼ等が活性化されて、目的タンパクを分解してしまう可能性があります。 サンプル温度が上がってきたら冷えるまで氷冷してください。 （30sec破砕→30sec氷冷の繰り返しとか）
お礼
参考になりました。ありがとうございました。
- jacknorantan
- ベストアンサー率0% (0/8)
簡単に説明しておきます。 １．大腸菌を培養する。 ２．それを集菌し、細胞を破壊する。 抽出方法はこんあもんでしょうか。 発現確認は、SDS-PAGEを用いて確認できます。
お礼
ご回答どうもありがとうございました。
関連するQ&A
- タンパク質抽出について
タンパク質抽出を氷上で行う理由について知りたいのですが、誰か詳しく教えてください。 私の考えとしては、タンパク質が温度によって変性してしまうから、安定性がどれくらいあるのかわからないタンパクを抽出するときは、氷上などの低温条件下での抽出が好ましいのではないか..... と考えているのですが、もっといろいろ考えられることがあるのかなとも思っています。 なるべく早い回答お待ちしています。
- 締切済み
- 化学
- 遺伝子組換えによるタンパク質発現
現在，タンパク質を遺伝子組換えにより，発現させたいと考えています．目的の遺伝子のORFの前に分泌シグナルを付加させ，分泌性タンパクを発現させたいと思います．宿主は酵母を用い，相同組換えにより発現させたいのですが，一般的に相同組換えによる分泌タンパクの発現量はどのくらい期待できるのでしょうか？相同組換え初心者ですので，経験者の方よろしくお願いします．
- ベストアンサー
- 生物学
- 発現蛋白質の精製
酵母を用いて組換え型蛋白質の発現・精製を行っています． 酵母を培養することにより，培養上清に蛋白質が発現してきます．この培養上清を，60％硫安+等電点で沈殿させた後，緩衝液で再溶解させ，陰イオン交換カラムで精製します． ところが，硫安+等電点沈殿させた蛋白質が上手く再溶解してくれません．溶解しない分画にもかなりの量の目的蛋白質がありましたので，どうにか溶解させようとトリトンを加えて溶解させました．しかし，今度はその加えたトリトンが最後まで残ってしまいました． 沈殿してしまった蛋白質を再溶解させる他の方法，またはトリトンを抜く方法をお知りの方がいれば，アドバイス等お願いします．
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質の一般的な発現量
各発現系の一般的な発現量を知りたいのです。 「一般的」というのは解釈に困る表現とわかっているのですが。 もちろん、発現させるタンパク質、培養条件などなどで 全然結果が違うのはわかります。 でも、それらを踏まえたうえでの「一般的」な発現量です。 参考にできる論文や書籍などありましたら教えてください。 一般的な発現量が知りたい発現系は ・大腸菌(E.coli) ・酵母(S.cerevisiae) ・酵母(P.pastoris) ・動物細胞 ・昆虫細胞 ・無細胞系（小麦胚由来） ・無細胞系(大腸菌由来) です。 例。大腸菌 数mg-20mgくらい とかで、よろしくお願いします。 もちろん、全ての発現系でなくても、幾つかわかる範囲でお願いします。 調べても、雰囲気はわかるのですが 一般的にだいたいどれくらいタンパク質が発現するかがわからなくって困ってます。
- 締切済み
- 生物学
- タンパク質の変性と巻き戻しについて
大腸菌を用いて15k程度のタンパク質を発現させてるんですが、ほとんど不溶画分にいってしまい、現在は変性剤等を用いて可溶化を試みています（低温培養、アルギニンの導入はダメでした） そこで初歩的な質問なんですが、 1、変性剤を用いるとタグまで変性してしまうのでしょうか？また、タグが変性してしまった場合、樹脂には吸着しないものなんでしょうか？（使っているタグはGSTです） 2、変性剤でタンパク質をグチャグチャにし、その後変性剤を取り除き、タンパク質を巻き戻すことで可溶化させるという手法において、どの段階で可溶化が起きているのかがわかりません 「タンパク質が正しい構造をとった状態（refolding）＝可溶化した状態」ということなのでしょうか？それとも変性した段階で可溶化が起っているのでしょうか？ よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 卵 タンパク質の変性
卵のタンパク質の変性について質問です。 タンパク質は、加熱することで変性しますよね？ しかし、変性することによって何か変化はあるのでしょうか？ 含有されるタンパク質の量が変わることはないのですか？ 詳しく教えて頂ければありがたいです。
- 締切済み
- 栄養・サプリメント（健康）
- たんぱく質の同定法について
ある分子が、たんぱく質であるかどうかを調べるにはどのような方法を用いて実験したらいいのでしょうか？ また、たんぱく質の発現量を調べるにはウエスタンブロッティングでいいのですか？
- ベストアンサー
- 生物学
補足
ありがとうございます。超音波のみで細胞壁も破砕されるのですか？それとも両方で処理する必要があるのでしょうか？何か参考になるサイトなどありましたら併せて教えて頂けますでしょうか？