ダイレクトシークエンス

質問

ダイレクトシークエンスをやりたいのですが、手技的に難しいものなのでしょうか？
また、どれくらいの長さのDNAまで読めるものなのでしょうか？

回答No.2

MIYD · ベストアンサー

FIVのシュードウイルスベクターからコロニーPCRで500~600bpのフラグメントをExTaqで増やして、
またはFIVのシュードウイルスベクター6~7KBを精製して、

それらをテンプレートにして
ABI3300とBigDye terminator Ver.3.1で読んでいます。
調子がいいと800bpくらいまで読めます。

310NTも同じくらい読めると思いますので、
いいプライマーとテンプレートがあれば、
4つくらいプライマーを設計すれば読めるのではないでしょうか。

LTR部分がテンプレートにあっても、
その部分はプライマーにしない方がいいです。
ダブルピークになり読めませんでした。

でも、FIVってRNAウイルスですよね。
テンプレートはどこから調整するのでしょうか。
ネコのゲノムから直接
(もしくはPCRで一回増やした溶液をテンプレートにして)
読むのは無理な気がします。

プラスミドなどにクローニングして大腸菌にいれて、そこから読むにしても、
一度PCRで目的のフラグメントを増やしてからの方がいいと思います。
http://www.shimadzu-biotech.jp/datahall/dsq/dsq08.html
私はExonucleaseとSAPは使わずに読めています。

補足

回答ありがとうございます。
FIVが細胞に感染すると、ウイルスRNAがDNAに逆転写されて細胞のDNA中に組み込まれ、プロウイルスという形で存在するようになります。私は、FIV感染細胞からDNAを抽出し、目的部分のPCRをして、それをテンプレートにしてシークエンスしようと考えていたんですが。

回答No.3

MIYD

もしかしたらそのまま読めるのかもしれませんが、
FIV由来のDNAとゲノムDNAをどのくらい分けて精製できるのかが
私にはわかりません。

SNPsやメチル化の解析では
nested PCRでゲノムのコンタミを減らして
直接読んでいるので、
そちらを参考にされてはいかがでしょうか。

回答No.1

MIYD

サンプルとシーケンサーはなんですか？

補足

ABI PRISM 310NTを使って、FIV（猫免疫不全ウイルス）の一部分（約1800bp）を読みたいのですが...