- ベストアンサー
シークエンス反応後のサンプルの保存について
ＤＮＡのシークエンス反応をした後に、そのサンプルは４℃で保存すべきなんでしょうか？－３０℃で保存すべきなんでしょうか？それともどちらでもかまいませんか？ 精製後の長期保存ならメーカーのマニュアルに載っているのですが、反応後は載っていません。 シークエンス反応をした後、精製を明日やりたいというときなのでオーバーナイト程度の保存期間です。 使用しているキットはBigDyeTerminator v3.0 Ready Reaction Kitです。 お願いします。
- taketaketakeo
- お礼率43% (120/273)
- 生物学
- 回答数2
- ありがとう数3
- みんなの回答 （2）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
- ベストアンサー
こんにちは。同じキット使ってます。 4度でOKです。サーマルサイクラーを、ラベリング反応終了後ずっと4度になるように設定しておいて、次の日の朝回収すれば問題ありません。 もしサイクラーから出さなければならない場合は遮光し、4度で次の日の朝までならOKです。それ以上の保存は試したことがありませんが、私は避けた方が良いと思います。ご存じだと思いますが、反応後にエタ沈してドライアップしておけば-20度で数週間は保存できますので、そこまで進めるように時間をとって実験した方が良いと思います。
その他の回答 (1)
- Hi104
- ベストアンサー率18% (10/53)
一般的に数日程度なら、４℃保存です。コンタミによる分解を心配するよりも、凍解凍の繰り返しによるダメージのほうが心配です。 要するに、どちらのリスクを取るかということですが、この手の質問は個々のサンプルの重要性との兼ね合いもあるので、研究室の先輩か先生に聞いてみてはいかが？それともそんなに信用できない人たちですか？
お礼
ありがとうございました。 ＞それともそんなに信用できない人たちですか？ いえいえそんなことはないです。 ４℃でいいんじゃないの？とは話していたんですが何か別の可能性が あったりするのかなと思い、ふと意見を募集したかっただけです。
関連するQ&A
- PCRの伸長反応について
PCRの伸長反応は，用いるDNAポリメラーゼによって僅かに異なりますが，大体70度前後だと理解しています． ところが，sequence reactionのサイクルでは伸長反応は60度と習いました． これは普通のPCRで用いるポリメラーゼとsequence reactionで用いるポリメラーゼが全然違うものだからなんでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAシーケンス
DNAシーケンスがうまくいきません。 800bpのPCR産物をTベクターに組み込んでおり、M13ForwardとM13Reverseのプライマーを使用し、両方向からシーケンスしています。 M13Reverse側からはうまくシーケンスできるのですが、M13Forward側からはうまく読めません。 同じプライマーを使って、ほかのプラスミドをシーケンスするとうまくいくのですが、このサンプルはForward側から読めません。 使用しているシーケンサーはABI3730 キットはBig Dye V3.1です。 サンプル量、プライマー量はキットで推奨されている量を使用しており、Big Dyeは1／4希釈です。 何度シーケンスしても読めないのですが原因は何が考えられるでしょうか。また、、何か解決策はあるでしょうか。
- ベストアンサー
- 生物学
- 遺伝子解析で（シーケンス反応）
細菌から抽出したDNAをPCRで数を増やしますが、次に行うシーケンス反応の時もPCRと同じように温度を変化させた反応サイクルを繰り返しますよね。この時蛍光マーカされたddNTPがくっついた伸長停止した色々な長さのDNAができると思うのですが、その色々な長さのDNAを作るために数十サイクルも反応行うのですか？PCRの時はDNAが増えますが、シーケンス反応の時はDNA自体は増えませんよね？その時伸長停止したDNAは熱がかかった時に再度解けてしまうことはないのでしょうか。 又シーケンス反応の終わったサンプルを洗浄乾燥し、再溶解して自動解析機（キャピラリ電気泳動）にかけますが、移動するDNAは伸長の止まった２重螺旋の状態で移動しているのでしょうか？ それと、解析結果が例えばＡ・Ｇ・Ｔだったとしたら、ddNTPのＡ・Ｇ・Ｔが付いていたという事でしょうかそれともddNTPのＴ・Ｃ・Ａがついていたという事でしょうか。 色々聞いてしまってすいません。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAの安定性について
シークエンス解析をしています。対象は、ゲノムをテンプレートとして増幅したDNA断片（PCR産物）をエタ沈したサンプルです。解析の結果を見ると、増幅時のプライマーが残っているのか、ノイズが多くてきれいに読めませんでした。エタ沈の条件を変えたりしたのですが、あまり効果はありませんでした。市販の精製キットでは少し効果があるようでした。ところが、３週間ほど冷蔵保存したPCR産物で解析したところ、以前の精製条件でも、ノイズが減ってきれいに読めるようになりました。そこで質問なのですが、冷蔵あるいは長期保存することでサンプルがきれいになって（例えばプライマーが分解して）、シークエンスがうまくいくというようなことがあるのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- シークエンス解析
実験初心者でして分かりにくい質問であったなら申し訳ありません。大変初歩的な質問で恐縮です。 現在癌細胞を用いてシークエンスを行っています（ABI310）。PCRmixを作り、PCRをかけてDNAの増幅を確認して、その後PCR産物を100倍希釈してテンプレートDNAを作りプレミックス、プライマー、SDWを加えもう一度PCRをかけて、できたシークエンスPCR産物を精製しシークエンサーにかけ塩基配列を読み取る方法です。一回目のPCRではバンドは大変はっきりと見え増幅が確認できるのですが、シークエンサーで結果を見ると4色蛍光のうち、赤（T）のみほぼ真っ直ぐな波形でわずかにクネクネと山型をなしており、きれいな山型が出ません。他の3色についてはピークはそう高くはないのですが塩基配列は一応読み取れます。何度精製を念入りに行っても同じ結果で困っています。アドバイス頂ければ有難いです。
- 締切済み
- 生物学
- 制限酵素処理後の保存
プラスミドに挿入したDNAのシークエンスをしようとしています。サイクルシークエンスを行うときプラスミドが環状のままではPCR反応がうまくいきません。そのためあらかじめ制限酵素で線状にしようと考えたのですが、制限酵素処理を行ったあと線状になったプラスミドの長期保存は可能なんでしょうか。長期でなくても一週間ほど保存できればいいのですが。
- ベストアンサー
- 生物学
- BeckmanのシーケンスKit マルチスクリーンを使ったDyeの除去について
BeckmanのKitを使ってシーケンスを行っています。 シーケンス反応後の未反応のBigDyeの除去にはミリポアのマルチスクリーンを使っています。 マルチスクリーンをかけたサンプルをSLSに溶解する前に65℃で水をとばす作業をしています。しかしながら、これが良くないようでシーケンスがうまく読めません。 そこで、凍結乾燥で濃縮しようと思うのですが、凍結乾燥もしくは遠心エバポレーションを行って濃縮してもサンプルに問題はないのでしょうか？ 凍結乾燥もしくは遠心エバポレーションを行っている方が折られましたら条件などをアドバイス頂ければ幸いです。よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- プラスミドDNAの精製
シークエンス反応に使うプラスミドDNAを抽出したのですが、反応が十分に行かないのか、塩基配列をあまり読むことができません。サンプルのプラスミドDNAの純度に問題があるような気がするのですが、純度がよいDNAを抽出する方法を(経験)コツなどを含めてご教授願えますでしょうか。 プラスミドDNAは大腸菌から抽出します。シークエンス反応はサイクルシークエンス法です。泳動はアクリルアミドゲルで行っております。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAの濃縮方法、分離&精製方法
300ulの溶液中に5ngのDNAが溶解しています。 このサンプルを使って、Whole genome amplificationを行ったところ、DNA濃度が低すぎるため、反応が上手く進みません。そこで、水分を蒸発させ、DNA濃度を高めて反応にかけたところ、今度は溶液中の成分が濃縮されていることが原因で、反応が上手く進まなくなりました。（ここで挙げている原因に間違いはありません。別な実験で確認を行っています） そこで質問は「溶液中のDNAだけを濃縮させる方法」を教えてください。ただし貴重なサンプルなので、極力DNAのロスは避けたいと思っています。ですので、エタノール沈殿法、シリカゲルを用いたカラムによる精製法などは避けたいと考えております。よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
お礼
ありがとうございました。