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遺伝子解析で(シーケンス反応)

細菌から抽出したDNAをPCRで数を増やしますが、次に行うシーケンス反応の時もPCRと同じように温度を変化させた反応サイクルを繰り返しますよね。この時蛍光マーカされたddNTPがくっついた伸長停止した色々な長さのDNAができると思うのですが、その色々な長さのDNAを作るために数十サイクルも反応行うのですか?PCRの時はDNAが増えますが、シーケンス反応の時はDNA自体は増えませんよね?その時伸長停止したDNAは熱がかかった時に再度解けてしまうことはないのでしょうか。 又シーケンス反応の終わったサンプルを洗浄乾燥し、再溶解して自動解析機(キャピラリ電気泳動)にかけますが、移動するDNAは伸長の止まった2重螺旋の状態で移動しているのでしょうか? それと、解析結果が例えばA・G・Tだったとしたら、ddNTPのA・G・Tが付いていたという事でしょうかそれともddNTPのT・C・Aがついていたという事でしょうか。 色々聞いてしまってすいません。

  • HPLC
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noname#14952
noname#14952
回答No.1

反応サイクルを繰り返すのは、転写産物を増やすためです。プライマーが片方にしかつかないので、指数関数的に増えるのではなく、直線的に増えていきます。ddNTPが取り込まれて伸長停止したDNA鎖は、次の熱変性で鋳型から離れ、温度が下がると再びプライマーがついて伸長を始めます。 反応産物は変性剤の存在化で電気泳動するので、1本鎖のままキャピラリの中を移動していきます。 解析結果がA・G・Tのときは、伸長したDNA鎖がA・G・Tを含んでいたことを示します。実際に検出されるのは、蛍光標識したddATP, ddGTP, ddTTPがそれぞれ酵素反応で伸長鎖の3'末端に取り込まれたものになります。

HPLC
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