サイクルシークエンス

質問

現在TOPO Cloning kitで約3kbのDNA配列を解析しようとしています。大腸菌への形質転換までうまくいきサイクルシークエンスを行ったのですがうまく増えません。使用しているprimerはT7 primerとT3 primerでkitに同封してあり濃度が0.1microg/microLでこの二つを1ng/microLに希釈しています。希釈の仕方がいけなかったのでしょうか？またサイクルシークエンスの注意点等があったらよろしくお願いします。

回答No.5

Chicago243 · ベストアンサー

サイクルシーケンスはPCRと違い途中で反応がある確率でとまる用にできていて、いろんな長さのDNAができます。ですから、シーケンスが読めるわけです。さらに反応でできるDNAは一本鎖なので普通のアガロースでみてもサイズは分からないと思います。
したがってサイクルシーケンス後のアガロースゲルの電気泳動の結果は(サイズは)参考になりません。
そのままシーケンサーまたはシーケンスゲルにアプライしてください。

お礼

長い期間で質問に答えていただきありがとうございました。先日シーケンサーにかけてみました。ですがうまく読むことができませんでした。今回の回答していただいたことを参考にしてもう一度最初から考え直してみます。

回答No.4

sheep7

シークエンス用のPCR反応で2.5kbのバンド、という状況が
イマイチ良く分からないのですが、ゲルに流してでたラダーが
2.5kbまであるということでしょうか？？そんなに長くは
読めないと思うのですが。

もしかして、と思ったのですが、プライマーを２種類とも
同じチューブに入れて反応させたりしていませんか？
最近、そういう人がいたので…。違ってたらすいません。

補足

うまく説明できず申し訳ありません。primerはちゃんと別々に入れています。PCRが終わったサンプルを電気泳動してみると2.5kbのバンドが確認されました。このバンドがPCR産物であると考えてよろしいのでしょうか。

回答No.3

Chicago243

まだ、私が理解しそこねているところがあるようです。おかしかったら指摘してください。

>バンドのサイズは2.5kbほどだったのですがサイクル
>シークエンスではこの大きさが出ることはあるのでし>ょうか

これは2.5kがシーケンスして読めるかどうかですよね。両方の末端から読んだ場合は読めないと思います。非常にうまくいってもせいぜい800-900bpsくらいでしょうか。
ターゲットの配列の途中にプライマーを設定することをおすすめします。ほかの方法がないことはないですがこれが一番手っ取り早いです。

補足

すみません。私の説明が悪かったようです。このPCRの反応で2.5kbのバンドが作成されるか？ということです。他のデータを見てみると大体1.5kbのバンドがサイクルシークエンスでできていました。今回できた2.5kbが若干長すぎるような気がして別のものではないかと危惧しています。

回答No.2

Chicago243

ありがとうございます。だいぶん状況がわかりました。おそらくプラスミドは電気泳動のパターンから適切なものを拾ってきてるでしょう。
ちょっと私も勘違いしてたかもしれません。
Big Dye Terminator Ver.3 サイクルシークエンスでは3.2pmolのプライマーが１反応に必要です。
T7&3 primer 1ng/microL は約0.15pmol/microLに相当します。ちょっと薄くはないでしょうか?

したのURLは濃度換算をしてくれるソフトです。

参考URL：

http://www.vector.co.jp/soft/win95/edu/se077186.html

補足

濃度を計算しなおし、再度PCRを行ってみました。するこ今度はバンドを確認することができました。バンドのサイズは2.5kbほどだったのですがサイクルシークエンスではこの大きさが出ることはあるのでしょうか？テンプレートに使用したプラスミドのサイズが7kbなのでテンプレートではないと思います。シークエンスにかけたい未知配列のサイズは3kbです。

回答No.1

Chicago243

もうすこし詳しい状況を教えてください。ポジコンはとったでしょうか?
まったく読めないのでしょうか?
プラスミドのインサートの確認はどのようにされたでしょうか?
どのようにプラスミドを精製されたでしょうか?
finalが1ng/microLならばそんなに外れた条件ではないとおもいますが、、、

補足

プラスミドの生成はQIAGENのkitを使いました。インサートの確認は生成したプラスミドをEco RIでカットして目的の断片が挿入されていることも確認しました。
primerは一度1ng/microLしてからそれを20microLの反応液と混合しました。反応条件は96℃で１分プレヒートをしてその後96℃20秒、50℃20秒、60℃4分です。
ポジコンはとっていませんでした。