分光光度計から物質含量率を求める方法

質問

サンプルに含まれる物質含量を計測するのに分光光度計を用いました。
吸光度と該当物質の検量線を求めたのですが、その回帰式に吸光度を代入して濃度を求めた数値が、含有率なのでしょうか？
サンプルを溶かした溶媒や物質の質量も用いて求めるものなのでしょうか。。。
基本的なことだと思うのですが、まったくわかりません。
とても恥ずかしいことなのでしょうが、どうか教えてください。ずっとわからなくて困っています。

回答No.9

noname#160321 · ベストアンサー

＃３、４、５です。賑やかなページになりましたねー。^^
質問を引用するのに画面分割したいー。(^^;
>>相関係数は0.9999なので、
真っ直ぐ過ぎます。実験誤差を考えると実測では0.95でも真っ直ぐ過ぎる。多分１点検量して比例計算したのだと思います。
>>その方はすでにご卒業なされており、
ってことは学生実験か博士課程前期、多分前者でしょうね。担当の先生は居られ無いのでしょうか？
>>体積モル濃度とも重量濃度とも判断できない状態です。
一番簡単な観点は、「当該物質」の分子量が知られている物質か、それとも高分子のように「平均組成」と「原料比」しか知られていない物質か、はたまた分子量は知られているがタンパク質のように巨大分子で数万、数十万、なんていうものかそれで大体分かります。
分子量が比較的小さくて紫外可視領域に吸収があるものには水溶性ビタミン系列のものなどがあります、例えばリボフラビン(VB2)分子量376.4、この場合多分「体積モル濃度」でしょう。
高分子だと水溶性デンプン(短波長だー)などもあります。この場合「重量/体積％」である可能性が高いです。
また酵素、ポリペプチドやタンパク質の場合、例えばα-アミラーゼ（たくさんあるとは思えないが)では(一例ですが)分子量5万から5.5万、この場合は「活性/体積濃度」などになっているみたい。
濃度の単位が分からない場合、検量線を作り直すか、他の情報源から吸光度を探し出して、昔の検量線がどの様な濃度を採用していたのかさぐることになります。
濃度から含量を求めるのは、皆さんが既に重複して答えていらっしゃいますが、再度まとめると：
「モル濃度」だった場合：
「濃度」*「希釈度」*「溶液の当初の体積」＝「含有当該物質のモル数」
(「含有当該物質のモル数」*「分子量」/「溶液を作成するときに用いた試料葉の乾燥重量」)*100=「当該物質の含有量」(重量％)
「重量/体積」濃度の場合：
「濃度」*「希釈度」*「溶液の当初の体積」＝「含有物質の質量」
(「含有物質の質量」/「溶液を作成するときに用いた試料葉の乾燥重量」)*100=「当該物質の含有量」(重量％)
「希釈度」が加わりましたが、これは＃８様がお示しのように、手順中に抽出液をｎ倍に希釈したときに、元の濃度は観察したサンプルのｎ倍だよ、と言うことです。
<(_ _)>

お礼

親身にご指導くださった皆さま、本当にありがとうございます。
先生が戻られるのを待ち、一からやり直そうと思います。
とにかく何かやりたい気持ちばかりで、何も理解できていませんでした。
まずはしっかり知識をつけられるよう、努力します。
edogawaranpoさん、bonjoviさん、doc_sundayさん、kgu-2さんに心からお礼申し上げます。
ありがとうございました。

補足

たびたびありがとうございます。
わたしは現在学部２回生で、この春から研究室に属します。
先生は４月末まで海外出張中で、同じくこの春修士に進まれる方に見ていただいているのですが、よくわからないとおっしゃられ、２人で悪戦苦闘しています。
卒研などでなく、研究室に属する嬉しさで実験室にある機械を使って何かやってみたく、
先生には許可をいただき、卒業生の論文など参考にしながら触ってみようというレベルです。
用語も統計も何もかもが不勉強でたくさんご迷惑をおかけしてしまい、申し訳ありませんでした。

回答No.8

kgu-2

だいぶ苦戦されているようなので。また、他の回答とダブル点、釈迦に説法の点は、ご容赦を。

>手元にある数値は、葉重量、抽出に用いた水量、分光光度計セル内の抽出液量およびその濃度となります。

　これだけあれば、簡単に計算できます。しかし、必要なのは、抽出液の濃度、抽出に用いた水の量、葉の重量で、セル内の液量は無関係です。これは、濃度から計算するからで、濃度は、普通は1ml中に含まれ重量ですから、全体の液量が多くても少なくても、1mlとれば同じだからです。

　葉の中に特定物質Aがはいっている。この葉の含有率を求める、ということで目的は間違っていませんよね。
　含有率=葉全体に含まれるAの重量／葉の重さ　です。
葉の重さは、簡単に測れるので、葉全体に含まれるAの重さが分かれば計算できます。
　ここで、葉全体に含まれるAは、全て抽出液全体に移ってきます(抽出という操作は、全部100%を液体に移すということです)。これポイントです。
ここで、葉全体は、分からないが、1ml中の濃度は、検量線から求められます(>分光光度計セル内の抽出液量および「その濃度」と書き込まれているので、)。「その濃度」というのは、1ml当たりの重さそのものです。
　葉全体の重さは、分からないが、それと同等のAの重さは、抽出液全体に入っています。抽出液全体=1ml当たりの濃度×全体の液量、ですから、この値が葉全体に含まれていたAの重さになります。あとは、これを葉の重さで割れば、含有量になります。

　抽出液は、測定には濃すぎる場合が多いのですが、その場合は抽出液を希釈します。希釈した場合は、当然希釈倍数をかけます。
　検量線は、極端に言えば一度つくれば、なんどでも原理的には使用できます。XさんとYさんがつくった検量線が異なるのは、理屈上はありません。仮に、別の分光光度計で測定しようが、検量線の横軸の濃度が同一ならば、全く同じになります。実際には、毎回つくりますが。

お礼

ご回答くださり、ありがとうございます。
抽出という操作は、全部100%を液体に移すということですと教えてくださりましたが、
わたしの行ったことはただ文献をまねて水に３日浸したといった感じで、これで１００％移せているのかも自分ではわかっていないのが現状です。
論文を読んでまねのようなものをしてみた程度で、根本的に全く理解できていないのが恥ずかしいです。
実験自体理解できるように出直します。ありがとうございます。

回答No.7

bonjovi

すいません。自分の回答に間違ったところがありました。
（試料溶液中の目的物質濃度）＝（サンプル中の濃度）×（試料溶液の体積）
この式は次の式に訂正します。
(試料溶液中の目的物質の絶対量(g)）＝（サンプル中の濃度）×（試料溶液の体積）
試料溶液の体積が分かれば求まると思います。自分の間違いで余計に混乱させてすみません。
溶液はもともと用意されていたものでしょうか。

お礼

再びありがとうございます。
溶液という言葉も間違って用いてる気がしてきました。
葉（試料）を水につけてその成分（目的物質）を抽出したものを溶液と呼んでいました。
すみません、もうただ恥ずかしくて申し訳ないです。
上手く説明できず、たくさん煩わせてしまったと思います。
こんな不十分なわたしの質問にずっとお付き合いくださり、ありがとうございました。

回答No.6

noname#21649

＞溶液中濃度と関わっているということのみで、試料中含有率 については何も理解できませんでした。
これは物質収支(物収.ブッシュう)の問題です。
http://irws.eng.niigata-u.ac.jp/~chem/itou/bce_bun4.html

ランバートベールの方程式が成り立つ条件(このあたりは５番の方のほうがきれいな説明ができそうなので.省略)で.

均一試料から適当な分量を取ってちょうせいした(セルの中に入れるようえきを作ること=適当な濃度に薄めた)場合は.

試料濃度をx, ぶんちゅう量(試料を採取した量)をyとします。これを適当に薄めて.あるいは.濃縮して.分析用溶液をさく製(ちょうせい)します。
ぶんちゅうした試料ちゅぅに含まれる目的成分mは.m=x*yで示されます。mの単位は分析だからgかな.それともSI単位系を使ってkgになりますか。私の習慣でg単位で以下の説明を続けます。ここでご質問者が日常使う単位を決めておくと後が楽です。

ちょうせいちゅうに外部への目的成分の移動(希散)や外部からの目的成分の移動(汚染・コンタミ)を考えないとして(必要な場合には.実験方法で補正しているはず。実験方法が質問分に記載されていないので.この部分は省略)計算すると

分析用溶液中に含まれるもく的成分量は.mとなり.分析用溶液量を１リットルとすると.m g/リットルとなります。

これで.試料濃度と分析用溶液濃度の関係は検討つきますか。

ご質問の内容は.以上の説明を逆に戻ってゆくと検討つくでしょう。

お礼

再びありがとうございます。
そしてお礼が随分遅くなり、申し訳ありませんでした。
ランバートベールの方程式、しっかり勉強します。
参考URLも教えてくださり、ありがとうございます。

回答No.5

noname#160321

＃３、４です。事情は分かりました。では基本的なところからいきましょう。
>>手元にある数値は、葉重量、抽出に用いた水量、分光光度計セル内の抽出液量およびその濃度となります。

まず「分光光度計セル内の抽出液量」は関係ありません。実際に光が通る部分だけしか測定に掛かっていないので、セル内の液量は分からなくて良いのです。

「濃度」ですが、
>>以前他の人が濃度調整した純正当該水溶性物質溶液から得た値より、検量線を求めました。
とのことですが、体積モル濃度なのでしょうか？それとも体積重量濃度（１L中にxxｇ）なのでしょうか？
そして、以前用いられた「当該物質」は「純物質」なのでしょうか？それとも「葉の成分の抽出液」なのでしょうか？
ついでに「検量線」は１点と原点（濃度ゼロで吸収ゼロ）だけの比例計算でしょうか？それともかなりの点(濃度)での値を連ねたゆがんだものでしょうか？大きく曲がったりしていませんか？
お答えをお待ちしています。^^

補足

再びありがとうございます。
濃度についてですが、「濃度○％・・吸光度○」といった記述で、
体積モル濃度とも重量濃度とも判断できない状態です。
その方はすでにご卒業なされており、確認することもできません。
しかし、純物質を濃度調整して作られたことは併記されています。
10段階に調整された濃度に対応する値から、回帰直線を得ました。
相関係数は0.9999なので、まっすぐと考えていいのかなと思っています。

セル内の液量が関係ないことも教えてくださってありがとうございます。
体積モル濃度か純物質で調整して検量線を作り直す必要があるのなら、入手できるかどうかがわかりません。
自分で考えながら試みたのですが、どうも無計画すぎて意味をなしていないようですね。。。
理解不足でご迷惑ばかりかけてしまい、本当に申し訳ありません。

回答No.4

noname#160321

済みません、初歩的なミスを訂正します。
>>」*「溶液を調製したときに使用した溶媒の体積（リットル単位）」
は間違いで、
*「溶液を調製したときに『出来た溶液自身』の体積（リットル単位）」
でした。(汗)
<(_ _)>

お礼

重ね重ね、とても丁寧なご説明をありがとうございます。
ご回答くださった方々にわたしの拙い理解と質問で、気分を害されてしまっていないかと
心配です。
呆れられているかもしれませんが、どうかよろしくお願いいたします。

回答No.3

noname#160321

>>サンプルを溶かした溶媒や物質の質量も用いて求めるものなのでしょうか。。。
「溶液中の濃度」と「原試料中の濃度（含有率）」を混同するとわけが分からなくなります。
まず「溶液中の濃度」から、
>>吸光度と該当物質の検量線を求めたのですが、その回帰式に吸光度を代入して濃度を求めた数値
これが「溶液中の濃度」もし体積モル濃度なら
「溶液中のモル濃度」*「溶液を調製したときに使用した溶媒の体積（リットル単位）」＝「調製したときに使用した原試料の中に含まれる当該物質のモル数」
この「…当該物質のモル数」*「当該物質の分子量（式量）」＝「調製したときに使用した原試料の中に含まれる当該物質の質量」
｛「…当該物質の質量」/「原試料の質量（重量）」｝*１００＝「当該物質の原試料中の（質量）濃度（≡質量含有率、パーセント）」
になります。
なお、検量線は他の物質の妨害のない波長で作っておられると思いますが、もし妨害があると、妨害物質の濃度を先に決め、使用している波長での妨害物質の吸光度を差し引く必要があります。
<(_ _)>

補足

分光光度計の操作を覚えようと始めた実験なのですが、
原試料（生葉）を水に浸し水溶性物質抽出液を得たのち、その抽出液を分光光度計で用いて蒸留水をリファレンスとして吸光度を求めました。
また、以前他の人が濃度調整した純正当該水溶性物質溶液から得た値より、検量線を求めました。

手元にある数値は、葉重量、抽出に用いた水量、分光光度計セル内の抽出液量および
その濃度となります。
これらだけでは葉に含まれる当該物質含量を大雑把に求めることは不可能なのでしょうか。
化学というより算数のような比で重量含有率（？）を求めてよいものなのでしょうか？

回答No.2

bonjovi

濃度と含有率は同じではありません。濃度は溶媒中にどの程度特定物質が含まれているかということを表すのに対し、含有率は用いた試料の中にどれだけその特定物質が含まれるか(つまり純度)を表します。要は、試料中には不純物がふくまれており、試料が単一成分で構成されているわけではありません。そこで、試料中にどの程度目的の物質が含まれるか求める必要があるのです。
したがって、含有率=試料中に含まれる目的の試料成分の重量(g)/用いた試料の重量(g)となります。
用いた試料成分の重量は実験テキストに書いてあると思います。また試料中に含まれる目的の試料成分の重量(g)は書いてある通り検量線から求めることができます。検量線からサンプル中の濃度が分かりますよね？求めた濃度に用いた試料溶液の体積を掛けてやれば試料溶液中の目的物質濃度を求めることができます。
そして最後に、これらの値を使って、先ほどの含有率の式に代入することで値が求まります。

お礼

以上を踏まえた上で、後半部分で混乱しています。
（試料溶液中の目的物質濃度）
　　＝（サンプル中の濃度）×（試料溶液の体積）とありますが、
検量線から求められるのは、 「サンプル中の濃度」？「試料溶液中の目的物質濃度」？
また、試料溶液の体積は何を求めるために用いたらよいのでしょうか。
正しく語句を使いこなせていないために、上手くお伝えできず申し訳ありません。

補足

とてもとても丁寧な説明をありがとうございます。
わたしの用いた語句がおかしく大変わかりづらくなってしまい、恐縮です。
bonjoviさんとdoc_sundayさんにいただきましたご回答から言葉をお借りして
自分の用いた言葉を整理しなおしますと、
「サンプル中の濃度」＝「原試料中の濃度（含有率）」のことであり、
「溶液中の濃度」＝「試料溶液中の目的物質濃度」
　　　　　　　 　＝「検量線に吸光度を代入して求めた数値」 のことなのだと思いわれます。

回答No.1

noname#21649

ランバートベールの式を解けばいみがわかるでしょう。
私がやると計算間違いをするので回答しません。

お礼

投稿前に過去ログを拝見し、吸光度で必ず出てくるランバートベールの法則を少しでも
理解しようとしました。
しかし、わたしに少しわかったのは分光光度計で算出される吸光度が溶液中濃度と関わっているということのみで、試料中含有率については何も理解できませんでした。
不勉強でまことに申し訳ありません。