ＰＡＧＥでの活性染色の方法

質問

酵素の活性染色法
ＰＡＧＥに、予め基質を混入させておいて
酵素液を泳動後に反応させて、染色する。

これをペクチナーゼを対象に行った実験
ペクチンをＰＡＧＥに加えておいて、
ペクチナーゼを蛋白電気泳動させて、
ルテニウム・レッドで染色させて、
活性のある蛋白を発見する。

という実験内容が
この↓論文に載っているそうなのですけど、

Cruickshank,R,H.,& Wade,G.C. (1980)
Detection of pectic enzymes in pectin-acrylamide gels.
Analytical Biochemistry, 107, 177-181.

取り寄せにちょっと時間が掛かりそうなので
(取り寄せられるかも不明です)
この方法についてご存知の方は教えてください。

基質の濃度とか、電気泳動の電圧とか。

しかし、基質を加えたＰＡＧＥの電気泳動って、
蛋白が基質に引っかかったりはしないのでしょうか。
ちょっと疑問です。

回答No.1

mizu_atsu · ベストアンサー

酵素も基質も違いますが
泳動後に反応させるということwやったことがあります。
ただ、私の場合は基質の分子量が小さいこともあり
泳動後に基質の入った液に浸してやっておりました。
ちなみに私のところではNativePAGEといってました。

＞基質を加えたＰＡＧＥの電気泳動って、
蛋白が基質に引っかかったりはしないのでしょうか。

多少は影響を受けるかもしれませんが受けたとしても問題はないでしょう。
そもそもこのPAGEは変成をさせていません。
そのため泳動距離は分子量に寄りません。
もともとの形状、大きさ、電荷に依存することになるからです。
この泳動の目的はどのくらいの太さのバンドに（つまりどのくらいの割合をしめている）タンパクが活性を持っているかを知ることだと思います。

＞基質の濃度とか

そうは反応すれば良いのであまり神経質になる必要はないと思います。
とはいっても私の場合は通常試験管内で行なう濃度でやっていました。でも、反応温度は適当で常温でやってました。

＞電気泳動の電圧とか。

私は普通にやってました。
基質は後から加えていたからかもしれませんが
先に入っていても変わらないのでは？と思います。

お礼

取り合えず、やってみることにします。
解答ありがとうございました。