293細胞へのダブルトランスフェクション

質問

293細胞にリポフェクタミンを使って2種の遺伝子を同時に遺伝子導入したいと考えています。1種類ずつ、2日連続で通常のプロトコールでトランスフェクションを行うのか、2種類のベクターを同時に混合して加えてもよいのかわかりません。
どなたかご教示いただけますとありがたいです。よろしくお願いします。

回答No.2

otx · ベストアンサー

２種類のDNAを混ぜて導入することをお勧めします。
この場合、例えば、totalで10まいくろグラムのDNAを加えたとします。
単純には５マイクログラム＋５マイクログラムと混ぜて、totalのDNA量を
１種類の時と合わせるとOKです。

この時、それぞれの発現量を調節したい場合は
それぞれのDNAの量の比を変えることで調節できます（もちろんtotalの量は変えずに）。

私は同時に４種類のプラスミドを混ぜて発現させたこともあります。

２日連続で通常のプロトコールは、やめた方がいいです。
その理由は少なくとも２つあります。

１つ目は、そもそもトランスフェクションする前日にまいた細胞の量は
コンフルエントに近い状態です。そのときにうまくいくようにリポフェクタミンの
プロトコールは出来ています。
なので、２回目のトランスフェクションの時には際簿が増えすぎです。

２つ目は、リポフェクタミンの毒性は結構あります。また、トランスフェクションで
遺伝子を強制発現させるのは結構細胞にダメージがあるときがあります。
なので、２回目のトランスフェクションの後、結構な細胞が死んでしまう可能性が高いです。

お礼

皆様、どうもありがとうございました。
2種類混ぜて、一度でトランスフェクションしてみます！

回答No.1

ga111

2種類同時で構いません。発現の比率をコントロールするにはプラスミドDNAの比率を変えます。このとき、合計が今まであるデータのうち最良のDNA量にします。

発現に違いがありすぎるなどの都合により、1種類ずつ、2日連続で通常のプロトコールでも構いません。