プラスミドDNAのトランスフェクションについて

質問

現在、pEGFP-N1というベクターに目的タンパク質をインサートしたプラスミドDNAを3T3-L1マウス繊維牙細胞にトランスフェクションしています。pEGFP-N1だけをトランスフェクションした場合、GFPが発現して緑色に見えるのですが、インサートが入ったプラスミドはなかなかトランスフェクションが成功しません。何かトランスフェクション効率が上がる方法はないですか?また、pEGFP-N1のトランスフェクションが成功しても、細胞を継代すると緑色に光らなくなります。継代するときのトリプシン・EDTA処理によるストレスが原因なのかなぁって思っているんですが、他に原因があるのでしょうか?
トランスフェクションは、QIAGEN社のsuperfectを使っています。

回答No.4

otx · ベストアンサー

細胞の種類とかというよりも、EGFP自体の発現はうまくいっていることから、扱っている遺伝子の影響が高いと思われます。ここではその遺伝子の名前は出せないと思いますので、その研究室で話された方がいいと思います。
極端に言うと、アポトーシスや細胞分裂を抑制的に働く因子の場合はその性質上発現が相対的に見て低くなります。
また、これまでのやりとりを見ていると、もう少し勉強をするというよりも、せっかく生で聞ける先生がいるのでしょうから、もっと直接質問した方がいいと思います。
また、先輩とかいるのではないでしょうか？事情をよく知る人に聞くのが最も早道です。

お礼

インサートの遺伝子産物の影響は少なからずあると思います。細胞が光らないのはプラスミドが入っていないかあるいはインサート遺伝子産物の影響で光らないのかはっきりさせるために、RT-PCRをしてcDNAをインサートにアニールするプライマーでPCRしたいと考えてます。ラボの先輩や先生とディスカッションすることも忘れずに。ありがとうございました。

回答No.3

alanami

３T３ラインは一般的に扱いにくいラインだと思います。例えばBalb/cマウス由来のBalb3T3は、最初に大量にストックを作製しておくのが原則です。血清等の影響ではなく、培養を続けると段々元気がなくなっていきます。ですからstable lineを取るのは困難だと思います。
トランスフェクションする細胞を変えては如何でしょうか。

お礼

先輩も3T3細胞系はトランスフェクションしにくいと言っていました。おっしゃるとおりトランスフェクションする細胞を検討してみます。ありがとうございました。

回答No.2

nonnon1190

＞GFPよりもインサート遺伝子産物の発現のほうが非常に大きく、そのせいでGFPの発現が抑えられているのかと考えています。

pEGFP-N1は目的遺伝子産物とEGFPがつながっている形で発現するので、この文章の意味はわかりませんが、目的遺伝子によって発現が異なるのはしょうがないのではないでしょうか。

＞dishを換えずにトランスフェクションで用いたdishのまま薬剤選択をかけることで細胞がstableになるということでしょうか?

いいえ。クローンを単離するのであればクローンになるように細胞数を加減してまき直します。

transientとは一過性発現
stableとは安定発現

一過性発現と安定発現は一般的にどちらが強い発現でしょうか？

＞、pEGFP-N1のトランスフェクションが成功しても、細胞を継代すると緑色に光らなくなります。

当たり前である気がしますが？
実際に、クローンでもバルクでもstableを取るというのはどのような作業をするか、理解していますか？
強い発現の細胞（もしくは細胞集団）を選ばなければならないのです。
一過性発現よりも安定発現の方が、弱い発現をする細胞が多いからです。

こういうことは基本的なことです。研究室の教官、もしくは先輩に聞きましたか？こんなところで聞く癖を付けたらダメです。

＞継代するときのトリプシン・EDTA処理によるストレスが原因なのかなぁって思っているんですが

こんなことを考えて、勝手に実験をしていると「あいつ何をやっているんだ？」と思われるようになり、そのうち無視されるようになります。

お礼

よく調べもしないで安易に答えを求めようとしてすいません。返答の文章を見る限り僕の勉強不足です。実験に対する指摘ありがとうございました。もっと自分で勉強してから質問するようにします。出直してきます。

回答No.1

nonnon1190

＞何かトランスフェクション効率が上がる方法はないですか?

どうしてtransfectionの効率だけを考えるのでしょうか？
コンストラクトがきちんとできていない可能性
インサート遺伝子産物の性質が影響している可能性
この２つは考えないのでしょうか？

＞また、pEGFP-N1のトランスフェクションが成功しても、細胞を継代すると緑色に光らなくなります。

transientとstable、そして薬剤によるセレクション。
これらの意味分かりますか？

補足

鋭い指摘ありがとうございます。
コンストラクトのことは、HEK293T細胞で同じプラスミドのトランスフェクションを行った結果、GFPが発現していることが確認できているので問題ないと考えています。インサート遺伝子産物の影響というのは、確かに大きく影響していると思います。GFPよりもインサート遺伝子産物の発現のほうが非常に大きく、そのせいでGFPの発現が抑えられているのかと考えています。
トランスフェクションのtransientとは一過性発現のことで細胞が導入プラスミドを持ったままの状態、stableとは安定発現のことで細胞のゲノムに導入プラスミドが埋め込まれることだと理解しています。トランスフェクションをした直後だとtransientの状態ですが、薬剤による選択をかけることで細胞がstableになると考えています。ということは、トランスフェクションを行った後、dishを換えずにトランスフェクションで用いたdishのまま薬剤選択をかけることで細胞がstableになるということでしょうか?僕のラボのプロトコールでは、24 wellプレートでトランスフェクションを行った後48時間経過した時点で細胞が蛍光を発しているか確認後、プレートの細胞を60mm dishに継代して薬剤選択をかけていきます。