- ベストアンサー
タンパク質と安定性
タンパク質の精製を行っています。精製についてはどの本を見ても「タンパク質によって精製法が違う」というのは分かったのですが、考慮すべき点のなかで(塩)安定性についてどのように考えればいいのか分かりません。また「タンパク質溶液は濃い方が安定」とよく書かれているのですが、私としては濃い方が凝集しやすいのではないかと思います。また、みなさんは目的のタンパク質を発現・精製したいときどのような点を考慮しながら実験を進めてるのですか?素人の質問で申し訳ないのですが宜しくお願いします。 あと、精製法を考える上で有用なサイトなどありましたら教えて下さい。長々と書いて申し訳ありません。
- みんなの回答 (3)
- 専門家の回答
関連するQ&A
- 発現蛋白質の精製
酵母を用いて組換え型蛋白質の発現・精製を行っています. 酵母を培養することにより,培養上清に蛋白質が発現してきます.この培養上清を,60%硫安+等電点で沈殿させた後,緩衝液で再溶解させ,陰イオン交換カラムで精製します. ところが,硫安+等電点沈殿させた蛋白質が上手く再溶解してくれません.溶解しない分画にもかなりの量の目的蛋白質がありましたので,どうにか溶解させようとトリトンを加えて溶解させました.しかし,今度はその加えたトリトンが最後まで残ってしまいました. 沈殿してしまった蛋白質を再溶解させる他の方法,またはトリトンを抜く方法をお知りの方がいれば,アドバイス等お願いします.
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク合成
現在、タンパクX(イムノグロブリンスーパーファミリー(IgSF)に属する分子量約120kDa)の合成を修飾等を考え、哺乳類細胞で行っていますが、今のところうまくできていません。また、IgSFに属するタンパクはできにくいという噂を聞いたこともあります。そこでいくつか細胞の種類を変えて試してみようと思っていますが、文献をみたところ、IgSFのタンパクはcos細胞を使っている場合が多いようです。しかし、目的が多量のタンパク精製であるため、一過的な発現系ではなく、恒常的な発現系を作りたいと思っています。また、哺乳類細胞ではなく、昆虫細胞を使った方がよいのでしょうか?ただ、昆虫細胞を使った実験系は行った事がないので、実際に動き出すまでに多くの時間と費用がかかりそうなのでできれば避けたいと思っています。 「こんなふうにしたらうまくいった」など、どんなことでもかまいませので、アドバイスがあれば、ぜひお願いしますm(_ _)m
- 締切済み
- 生物学
- 血清検査-総タンパク質濃度の求め方
先日血清検査を模した実験をしたのですが、濃度の測定法に疑問があります。 実験内容は (1)精製水(2)タンパク質標準溶液(3)血清 をが入った試験管を用意し、それぞれにNaOH、ビュレット試薬を加え30分放置してから(1)精製水を対照にして吸光度を測定し、総タンパク質濃度を求めるというものです。 しかし、この求め方では血清に含まれるイオンなど、タンパク質以外も含む濃度しかもとまらないのでは?と感じました。この値を総タンパク質濃度としていいんでしょうか? あと、NaOHはなんのために入れるのでしょうか?
- 締切済み
- 化学
- GST融合タンパク質発現ベクターpGEX6Pについて
初めて質問いたします。 現在GST融合タンパク質を発現、精製するために、 pGEX6P-1(GEヘルスケア)というベクターを用いております。 培養条件は37度でOD0.5まで培養し、 IPTG 0.05mMまで添加後、 20度でovernight、培養しております(ホストはBL21でDE3ではないです)。 その後グルタチオンカラムで精製すると、 なぜか目的のタンパク質のほかにGSTそのものも発現しております。 他の目的タンパク質を導入した際にもこういったことがおきております。 こういったことは一般的なのでしょうか? かなりGSTが発現してしまっているので、 カラムで精製したときに目的タンパク質の収率が非常に悪くなっているように思います。 アドバイスいただけますと助かります。 よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質の保存期間
Hisタグつきタンパク質をNiキレートカラムで精製し、 イミダゾールで溶出したのですが、 そのまま4℃で保存する場合、イミダゾール溶液中ではタンパクはどれくらいの期間安定に保存できるものでしょうか? タンパク精製に不慣れなため、ご回答よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- GST融合タンパク
現在、目的のたんぱく質をGST融合タンパクとして大腸菌内で発現させ、アフィニティーカラムを用いて精製を行っています。上清には十分量でてきているのですがカラムを通してもほとんど吸着しません。しかも少ないながらも吸着したものを溶出してもでてきません。グルタチオン濃度を上げてみましたが変わりませんでした。トラブルシューティングを参考にしながら考えられるところを変えてみましたが改善されませんでした。周囲の人に聞いても良い回答は得られませんでした。現在のところ目的のタンパク質の構造による影響と考えていますが、このままではいつまでたっても十分量精製できないので非常に困っています。同じ様な経験がある方、こんなふうにしたら解決したなどありましたらおねがいしますm(_ _)m ちなみに目的としているタンパク質は20kDaです。
- ベストアンサー
- 生物学
- Fc融合タンパクの精製について
タンパク関連の実験をしている大学生です。 研究材料のため、分泌型Fc融合タンパクを動物細胞で作成しています。 目的のFc融合タンパク遺伝子をベクター(pcDNA3)に組み、動物細胞にトランスフェクションし 分泌させて回収し、プロテインAカラムを使用して精製しております。 精製したものを抗Fc抗体でウエスタンブロッティングを実施すると 目的のタンパク+Fcタンパクの分子量のところのバンドの他に、 Fc単体である約25KDaの所にもバンドが確認されました。 この遊離のFc単体のタンパクは、どうして存在するのでしょうか? Fcと目的タンパクは必ず融合して発現するものの、Fcとの間で切れてしまうのか、 目的のタンパクとFcをコードしている遺伝子において、時にFcの所からしか翻訳 されないことがあるのでしょうか? この遊離の単体Fcはどこからくるのか、どなたかご存知でしたら教えていただきたいです。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
お礼
ありがとうございます。大変参考になりました。