酵素活性

質問

現在リパーゼの活性を測定するにあたり、基質にOD405で測定するフェニル物質を使用しています。このモル吸光係数は18.5cm/umolです。
また基質を16.1mg、緩衝液などで35mlメスアップしています。これを0.95ulに酵素0.05で反応させ活性を調べたいのですがunit/mlの計算方法が分かりません。誰かお願いします。ちなみに1分間に1umolの基質を分解するのに要する酵素活性を1unitと定義しています。

回答No.2

bioxyz

再質問、拝見しました。

推測せざるを得ない部分が多いため、大学や病院の検査室等をイメージしてスケール等を変更した上でお答えします。

１）大過剰の基質が入っている
２）基質の 405 nm のモル吸光係数は0 (mM・cm）^-1　単位に注意、 u　は m にしました
３）分解産物のモル吸光係数が 18.5 (mM・cm）^-1
４）反応は時間に正比例している
５）u はミリと解釈する場合あり。ただし私はマイクロの意味で使います。
６）1 ml の反応系である（1 マイクロリットル は非現実的）
７）基質量は分子量が示されずにグラムのみで示されているため無視

の条件での計算式を記します。

10分間の吸光度の変化は 0.63 ですので、10分間あたりの分解産物の濃度変化は
（0.65-0.02）÷18.5＝0.034 （mM/10min)

単位時間あたりの濃度変化は3.4 uM/min

反応液が１ml であることから反応液中の分解産物量の変化は
3.4 uM/min * 1 ml=34 nmol/min

加えた酵素は0.05 mlであることから、1 ml の酵素液の場合に換算すると

34 （nmol/min）/0.05 (ml) = 680 (nmol/min)/ml = 0.68 （umol/min)/ml = 0.68 unit

となります。

申し訳ないのですが、仮定の話が多すぎて自信がありません。そのため、計算の見直しもしてません。
また、普通の実験として考えた場合、例えば反応液に加えて良い酵素液の量や、コントロールのとり方等の注意が必要ですので、遊びや実習でないのであれば、教官や身近な専門家のアドバイスを受けることをお勧めします。

少し偉そうな回答になってしまってすみません。私の無知や誤解でしたらご容赦ください。

回答No.1

bioxyz

計算するにあたっては、あと２つの情報が必要です。
（a）基質の分子量（モル濃度を知るため）
（b）反応産物の405nmの吸光度（0かもしれませんが要確認、基質分解量の計算に差をとるため）

測定と計算方法ですが、まず、
（１）単位時間あたりの反応液中の吸光度の減少を測定し、
（２）測定した基質濃度の減少から基質量の減少を計算します。この時、基質量（濃度）の変化で反応速度が落ちるようなら、基質が十分濃度ある場合の値を計算します。
（３）基質が十分濃度存在する場合の基質分解速度（umol/min)が計算できたら、
（４）この系には0.05ulの酵素液を用いたことから、酵素液1mlを用いた場合の値に換算すればＯＫです。

ただし何らかのデータとして用いたいのであれば、他にも注意すべきことがいろいろあるように感じますので、身近な専門家のアドバイスを受けることをお勧めします。

補足

回答ありがとうございます。
(２)の計算の測定した基質濃度の減少から基質量の減少の具体的な計算方法が分かりますか？
今回は基質を分解させ反応産物の405nmの吸光度で測定され増加します。(10minで0.０２→0.65に変化)