• ベストアンサー
  • すぐに回答を!

粘菌の発生過程におけるプロモーター活性の検出

最近行った実験においてなんですがよくわからないので質問します。 まず概要から、粘菌を形質転換させたものとさせていないものをそれぞれ発生させてから0h,16h,20h,24hおいたものを作りました。これをまずたんぱく質濃度の測定をしました。ここで280nmの吸光度を測定しました。 次に、ONPGを基質としてβ-ガラクトシダーゼ活性検出をしました。これはまず、ZO-buffer,ONPG溶液,細胞破砕液を攪拌したあと、37度で30分間保温した。この後、Na2CO3溶液を加え攪拌し反応をとめた。その後、420nmの吸光度を測定しました。 最後にOD420/OD280の値をプロットし、プロモーター活性の継時変化を調べた。 このような実験をして、なぜこのような方法でプロモーター活性が計測できるのか教えてください。 そして、なぜOD420/OD280の値でプロットしなくてはならないのかも教えてください。お願いします。

共感・応援の気持ちを伝えよう!

  • 回答数1
  • 閲覧数211
  • ありがとう数1

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • 回答No.1

Relative β-galactosidase activity was standardized by dividing the β-galactosidase activity (OD420) by the respective OD280 of each individual sample.

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

質問者からのお礼

ありがとうございます。

関連するQ&A

  • 吸光度によるプロテアーゼ活性測定について

    プロテアーゼ活性についていまいち理解できないので教えて頂きたいです。 今回、ヘモグロビン溶液に、5μg/ml、10μg/ml、15μg/mlに希釈したペプシン溶液を加え、TCA溶液で反応を止めて、遠心分離してできた上澄み液の吸光度を測定する実験でした。 また、それぞれの濃度には1本のブランクを用意し、ヘモグロビン溶液にあらかじめTCA溶液を加えておき、そこに各濃度のペプシン溶液を加えて吸光度を測定しました。 教本に「反応液の吸光度からブランクの吸光度を差し引いた値がプロテアーゼによって遊離してきたアミノ酸量に相当する。 反応液中のTCA可溶性物質(遊離したアミノ酸)の280nmでの吸光度0.001の1分間あたりの変化が1単位に相当する。 1単位=280nmでの0.001の吸光度変化/1分間」と書かれており、 プロテアーゼ活性を計算しなくてはならないのですが… そもそもプロテアーゼ活性とは何なんでしょうか…。調べはしましたが、文献に載っておらず、いまいち理解できませんでした。 それから、例えば、吸光度が 反応液:0.830 ブランク:0.339 の場合、単位は何単位になるのでしょうか? 回答下さると助かります。宜しくお願いします。

  • 吸光度測定と酵素活性測定法

    化学の実験で乳酸デヒドロゲナーゼを280nm吸光度測定したらほとんど検出できなかったのですが、酵素活性では測定できました。 これは、つまり酵素活性測定法の方が感度が高いということなのでしょうか?また、特異性の高い測定法はどちらなのでしょうか。周囲と話し合ったのですが、 A.酵素活性測定法の方が特異性が高いという側の意見 →酵素は基質特異性があるから、特異性を示すのはこっち B.280nm吸光度測定法の方が特異性が高いという側の意見 →280nmは芳香環をもつ物質に特徴的な吸光度なので、特異性を示すのはこっち という意見がでて、分からなくなってしまいました。ご存知の方がいらっしゃったらアドバイスいただけないでしょうか??宜しくお願いいたします。

  • 吸光度のついて

    Lowry法により、BSA溶液を用いて、タンパク質の定量の実験を行いました。そこで、吸光度を測る際、750nmの吸光度を水を対照として分光光度計で測定したのですが、「750nm」という値は、実験により、青色に呈することに関係するのでしょうか?吸光度についてよくわからないのでよろしくおねがいします。

  • ペプシン活性の時間変化について

    なぜ、ペプシンと基質を反応させる時間を増やすと、吸光度(A280,OD280)が増加するのでしょうか。 実習で、ヘモグロビン溶液を基質として、ペプシン(酵素)を混ぜた時、一定の時間ごとに吸光度(280nmの紫外線をあてました)を測定しました。 吸光度と時間を対応させたグラフは、 最初に直線的に増加した後に、頭打ちしたような形になったのですが、 ペプシンと基質を反応させる時間を増やすと、吸光度(A280,OD280)が増加する理由が理解できません。 トリプトファンやチロシンなどのアミノ酸は紫外線の吸収極大が280nm付近なので、 吸光度は、トリプトファンやチロシンなどのアミノ酸量を示す…と理解していたのですが、 この理解だと、 酵素と基質を反応させる時間を増やし、 ペプシンによって例えペプチド結合が切り取られる部位が増えたとしても、 トリプトファンやチロシンの割合は変化しないはずではないか… という結論に至ってしまいます。(結果との矛盾) ペプシンによって基質が切り取られると、 トリプトファンやチロシンが露出する形となり、 吸光度が上がる…というのが今のところの私の予想なのですが、 この予想であっているのでしょうか。 理由を知っている方や、こういう考え方もあるのではないか、という提案のある方は教えて頂きたいです。よろしくお願いいたします。 また、このペプシン活性測定方法は、Anson法というらしいのですが、 このAnson法について詳しい文献を知っている方がいらっしゃいましたら、 それも教えて頂きたいです。 長々とすみませんが、ご回答よろしくお願いします!

  • 酵素活性の計算について

    市販のキッドにより、αグルコシダーゼの酵素活性を測定しています。 PNPGにαグルコシダーゼを反応させ、分解物のPNPを波長400nmで吸光度を測定し、 αグルコシダーゼ活性(U/mL)=(試料の吸光度ーブランクの吸光度)×0.171×試料の希釈倍率 とゆう計算式により酵素活性を求めるのですが、この0.171という数字はどこからくるのでしょうか? ご教授よろしくお願いします!!

  • 吸光度について

    β-D-ガラクトシダーゼがo-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシドを加水分解し、ガラクトースとo-ニトロフェノールを遊離させ、o-ニトロフェノールを定量することにより酵素活性を求める実験をやるのですが、調べてみると、吸光度をはかるときに280nmでやるときと420nmでやる2通りがあったのですが、どう違うのかが分かりません。 280nmはタンパク質に使われるのは知っているのですが、この実験で使うのか?と疑問です。

  • Km値の求め方がわからなくてとても困っています。

    Km値の求め方がわからなくてとても困っています。 乳酸脱水素酵素活性の測定という実験をしました。 リン酸緩衝液、ピルビン酸ナトリウム、NADH、ネズミの肝臓のホモジネートが入った溶液の吸光度を15秒間ごとに測り、吸光度の減少率(ΔA/min)を求めた。 減少率は0.416でした。 酵素活性(反応速度)は0.02×10^6となりました。 ホモジネートのたんぱく質濃度は1.34 酵素の比活性は14.97でした。 この結果からKm値を求めないといけないんですが、まったく計算の仕方がわかりません。 ラインウェーバーバークのプロットが検索でひっかかるのですが、どの値を使えば求められるかわかりません、 ラインウェーバーバークのプロットで求めることができるのかもわかりません。 どなたか分かる方、教えてください。 お願いします。

  • GFPを使ったプロモータ活性測定

    プロモータ活性を測りたい時、今の主流はルシフェラーゼアッセイですねよ。 でもGFPのほうが発光試薬も必要ないし、遺伝子サイズも小さいしで、 おんなじことをGFPでやったほうが便利なように思うのですが。 少数ながらGFPでプロモータ活性を測定している実験もあるみたいですがあまり一般的ではないようですし、 そういうキットを発売しているメーカーも見つからないです。 やはりルシフェラーゼにはGFPには変えられないメリットがあるのでしょうか? ダイナミックレンジが広いとか?測定機器が比較的安い?シグナルが強い? 何かご存知の方、GFPでプロモータアッセイしている方いらっしゃいましたら教えてください。

  • RNAの濃度測定

    RNAの濃度を決めるために260nmの吸光度を測る場合、もし、測定用に希釈した溶液にRNaseが混入してしまって分解されたら、260nmの吸光度の値は変るのでしょうか?

  • 吸光度から濃度を測定

    吸光度から濃度を求める問題が分からなくて 波長が260nmで吸光度が20ODの溶液1ml中には約1mgの溶媒が含まれている 吸光度200nmの時の溶液1ml中には何mgの溶媒が含まれているか? と言う問題なんですけど、 どうすれば解けるのでしょうか?