酵素反応における基質阻害について

質問

ある薬物代謝酵素の酵素活性を測定しています。
いろいろと論文を調べて反応系を組み立てましたが、
基質濃度が50μＭ以上になると基質阻害が起きてしまいました。
論文のデータによると少なくとも基質が200μＭまでは普通にミカエリス・メンテンに従うのですが・・。

基質はＤＭＳＯに溶かしており（論文でもＤＭＳＯ使用とのこと）、酵素反応に用いた基質濃度はそれぞれＤＭＳＯで希釈しました。
ＤＭＳＯの最終濃度は１％に抑えています。

研究が進まなく困っています。
どなたか回答をお願いします。

回答No.4

noname#21649

＞反応液の総量は１００μL程度になっており
より思い出したこと。この程度の分量の場合ぶんちゅうきの精度が極端に低いはず。容量計の精度を確認してみてください。

回答No.3

noname#21649

＞普通に３７℃で３０分インキュベートす
「普通に」どこに放置するか.で温度分布に大きく影響します。空気槽ですと２時間以上放置しないと室温とかわりないし.水槽でも温度が安定するまで１時間は保ちたいです。そうしないと温度が安定しません(室温側に近い温度となりやすい)。
酵素ではないのですが反応物によっては.穏やかな温度変化を必要とするために.-5度空気層で２時間放置後の薬剤を食う起草中で混ぜて反応させる場合(混ぜた直後に2-3度くらい上昇)があります。この場合.水槽中で反応させる(-5度で常に一定)と絶対にうまく行きません。

どちらを使っているかは過去の報告を読み直す必要があります。「普通」という言葉は研究所が異なると「きわめて特異な」という意味になる場合があります。

お礼

インキュベートは３７℃の水浴で３分間プレインキュベートさせた後、補酵素を添加することで反応を開始しています。
反応液の総量は１００μL程度になっており、参考にした論文と同じ条件で反応させていると思います。

言葉が適切ではなかったです。すみませんでした。

回答No.2

MIYD

質問文からだと基質とDMSO以外の話が無いので
他の条件は合っているとして話を進めますが

DMSOや基質のグレードはあっているのでしょうか。
final 1% DMSOで酵素反応の阻害はおこらないことは確認されていますか。

DMSO以外に基質を溶かせる溶媒はありませんか。

後は論文を出したコレスポンディングオーサーに問い合わせるか、
その論文は参考にならないものとして扱うかでしょうか。

お礼

回答ありがとうございます。
１％ＤＭＳＯでは阻害が起きないことは確認してあります。
基質の溶解性の問題で、ＤＭＳＯにしか溶けないとのことでした。

他の筆者の論文も見ているのですが、同じように基質阻害なんて起きていませんでした。

回答No.1

noname#21649

＞論文のデータに
の酵素活性を含めた単位が合っていますか。

標準がある世界でも対数で0.5くらい狂っているのが日常的です。まして単位がはっきりしていない酵素の場合は影響が大きいです。

温度分布あっていますか。論文の著者の過去の報告を読み漁って.「どのような環境で測定しているか」を調べてみてください。高温側から指定温度に合わせたか.低温側から合わせたか.恒温で行ったか.で大きく変化することがあります。

生物の方ですとあまり気を使わないのが水。水の製法と殺菌条件を読み漁ってください。ある報告では.上水道中の銅イオンの影響を受けた状態で報告されていました。炭酸とか容器からの重金属とかも注意が必要です。

お礼

回答ありがとうございます。
温度分布についてくわしくないのでよくわかりませんが、普通に３７℃で３０分インキュベートする方法をとっています。

水はミリＱを使用しています。
銅イオンなどの金属とかですね、今後注意してみることにします。
ありがとうございます。