G418の濃度（セレクション）

質問

これからネオマイシン耐性のプラスミドを導入してセレクションを行うために、プラスミド導入前の細胞がどの程度のG418濃度でアポトーシスが誘導される検討を行っているのですが、力価として3000 μg/mLまで濃度を上げましたが全然死んでくれません。

細胞は株化された血管内皮細胞なんですが、wakoの試薬情報では哺乳系細胞では100～2000 μg/mLとなっています。

今後、G418濃度を上げ続けてセレクションするのがよいのか、それともいっそのこと耐性遺伝子を変えてしまうのがよいのか迷っています。

どなたかアドバイスよろしくお願いします。

回答No.3

otx · ベストアンサー

ほとんどの細胞はある程度のG418を加えると、細胞分裂が遅くなります、経験上。
それを考慮にいれて１週間くらい継代なしで培養できるくらいの細胞数ではじめます。
しかし、あまりに少なすぎると、通常の濃度よりも低いところで死にやすくなりますのでご注意を。

もともと、遺伝子を導入した細胞をセレクションする場合、セレクションられた細胞が増えるまでの期間が２～３週間かかりますので、それを想定して１週間くらいで死ぬ薬剤の量を継代なしで検証する必要があります。

継代するとその行為で細胞が痛みますので、正確な検証ができません。
独学とのことですが、こういう実験はやったことある方に、実際に細胞を見せてもらいながら教えてもらうことが重要です。

お礼

>rnotk720さん、otxさん

色々とありがとうございます。

やはり初めての実験というのは、なかなかイメージがしにくく大変でしたが、ようやく遺伝子工学実験ノートなどの本に書いてある内容と、僕の中の実験のイメージがまとまってきました。

もしも、またわからないことがあったときはよろしくお願いします。

回答No.2

rnotk720

まず最初に、あなたの行っているのは一般的にキルカーブと呼ばれるもので、ネオマイシンレジスタンスを持たない状態の細胞がどれだけのネオマイシンの濃度で死亡するかを測定するためのものです。

ここで気をつけなければいけないことがいくつかあります。
まず、ネオマイシン（Ｇ４１８）はすぐに効くものではありません。
最低でも１週間ないしは２週間の培養期間を与えた上で、９０％近い細胞を殺すことのできる最低限の濃度を調べなければいけません。

また、Ｇ４１８は細胞分裂をしている細胞にしか効きません。ですから、もともと培養した細胞が多すぎた場合、Ｇ４１８はまず効かないと思ってください。

最後に、ごくまれにですがＧ４１８に元から耐性を持った細胞もいます。これらの細胞はキルカーブには使うことができませんので、ご注意ください。

実験うまくいくことを願っています

回答No.1

rnotk720

３０００はかなり高い濃度の気がします。
この濃度で何日ぐらい培養されたのでしょうか？
もし、この濃度で２週間以上アポトーシスが観察されないようなら、
私なら、Ｇ４１８を新しいものに買い換えてやり直すと思います。

お礼

実際に培養した日数は３日間なのですが、３日後のMTTアッセイの結果で細胞生存率が90-100 %（n=3）という結果でした。

一点教えていただきたいのですが、2週間以上培養するというのは、その間に系代培養を行ってもよいのでしょうか？

当研究室でセレクションなのどの操作は僕が初めて行っており、独学で検討しており、知識が追いついていないことがあるため、色々教えていただけると幸いです。