エタノール沈澱で、沈澱が出ませんでした。

質問

エタノール沈澱で、沈澱が出ませんでした。

環状プラスミドをエタノール沈澱しようと思い、フェノール処理→クロロホルム処理→NaOAc添加後エタノール沈澱と操作をしました。ですが、全く沈澱が生じません。
現在、溶液中にはエタノールとNaOAcとプラスミドが100μg/mL程度の濃度で共存している筈ですが、この状態からプラスミドを回収する方法はあるでしょうか？教えて下さい。

回答No.2

otx · ベストアンサー

そもそも、エタチンメイトは、共に沈殿して
その時DNAも絡めとって効率よく沈殿させようというものです。

なので、エタチンメイトを加えると「エタチンメイトの沈殿」が目に見えて当たり前です。

さて、100μg/mL程度の濃度でDNAがあるとありますが、
濃度ではなく「DNAの総量」はどのくらいになるのでしょうか？

結局、ペレットの大きさというのはDNAがどのくらいあるのかに依ります。
その量が少なければ、沈殿はしていても目に見えないというときはよくありますし、
また、量が少なければエタチンメイトのような共沈剤を用いなければ沈殿の効率が悪いこともあります。
同じ量でも純度が高い場合、見えづらいということもあります。

そして、もし目に見えなくても、延伸するときのチューブの方向性を決めておくことによって
「ここのチューブの底に沈殿が出来ているはず」と目星を付けて
目に見えないペレットを想定して実験をするのはいつものことです。

お礼

回答有難う御座います。

＞濃度ではなく「DNAの総量」はどのくらいになるのでしょうか？

チューブによっても異なりますが、15μg～25μgは存在すると思います。

＞同じ量でも純度が高い場合、見えづらいということもあります。

このことは知りませんでした。純度が高いとは思うので、そのせいかもしれません…
毎回ペレット状に沈澱が出来ていたので、今回も出来ているものだと思っていました。
「ペレットがある筈」という推測でやってみようかと思います。
有難う御座いました。

回答No.1

prumin

エタ沈の場合，沈殿が目に見える量とは限りませんが，
上清に残っているという確証はありますか？

お礼

回答有難う御座います。
確証はあります。というのも、エタノール沈澱が出ず、たまたまクロロホルム抽出の際に若干上澄みとして残っていたものをエタチンメイトともにエタ沈したらそっちは沈澱が目に見える形で生じ、その後酵素処理→アガロースで泳動をかけて、バンドがしっかり出たので上澄みにDNAははいっています。