cDNA合成

質問

ImpromIIreverse trascripsion system でRNAからDNAを合成しています。
いつもはtemplateとしてRNA１μgにtotal20μlなるようにdNTPやBufferなどを加えて合成していました。

今回、96wellで培養した細胞からRNAを抽出したところ、濃度3μg/mlとかなり薄かったです。これはtotal10μlあります。
これでは1μg加えるには濃度が薄すぎます。。。。
PCRにしようするためのｃDNAをこの濃度、量で十分に合成することはできますか？？
よろしくお願いします。

回答No.1

noname#67386 · ベストアンサー

私はinvitrogenのSuper ScriptIIRTシステムを使っています。
そのプロメガのシステムについてはわかりませんが、そこまで変わらないと思いますので回答させていただきます。

私は一時期RT-PCRに用いるcDNAの合成にはtotalRNA量を10ng/RT反応として用いておりました。
それを考慮すればkurouridさんは30ngはあるので大丈夫でしょう。
ちなみにinvitrogenのプロトコルによればtotalRNA1ngから可能だそうです。

ただ恐らくDNaseによる処理を行うと思いますのでさらなるロスを覚悟しなければなりません。

あと、蛇足ですが他のサンプルと発現比較解析など行う場合にはRTには当然この一番薄いサンプルに合わせなければなりませんのでご注意を。

補足

1ngから可能なのですかっ、そんなに少量からも可能なんですね。
今回、cDNA合成プロトコルを少し改変してRNAを余分に入れて行ったところ十分量のcDNAが得られました、ありがとうございました。

回答No.2

otx

質問の答えじゃないですけど・・・。
それ、本当にRNA回収できているのでしょうか。
実際、泳動なんかで見たのならともかく（その濃度のままでは見えないでしょうけど）、吸光度とかでは、そんな薄い濃度は不正確極まりなく、実際はRNAは存在しない気がしますが・・・。
どれだけ少ない細胞から抽出してるかわかりませんが、少なすぎではないでしょうか。

補足

実際はRNA抽出後に100倍（今回は薄かったので10倍）希釈して測定しています。
毎回0.5-50μg/ml位の値が出力されます。
細胞数は4×10^3以上位です。

ちなみにcDNA合成プロトコルを少し改変して行ったところ、なんとか十分量得ることができました、ありがとうございます。