ピペッティング

質問

とても初歩的な質問です。
PCRを行う前の、PCR溶液を作るときのピペッティング操作について質問です。
PCR溶液は、Free水やdNTP、PCR Buffer、Taq、プライマーなどを加えていって作ります。
その加えていくときなのですが、例えばdNTPから10μl取ってPCRチューブに移して加えるとします。
dNTPから取るときにピペッティングしてから10μl吸い上げ、そしてPCRチューブに移してPCR溶液の中でさらにピペッティングして出し切る。
この操作は正しいのでしょうか。
お聞きしたいところは、dNTPなどの溶液から吸い上げるときに、ピペッティングしてから吸い上げるのか、ピペッティングしてはならないのかということです。
よろしくお願いいたします。

回答No.3

CTAB

うちの研究室でのルールとしては、
PCRの際の水やバッファーがベースの液（dNTPやPrimer溶液）はピペッティングは無しでした。コンタミしそうですし、チップに付着するロスなんてあってないようなものですから。うちの研究室は共通試薬をチップで吸ってから中に戻す操作は全面禁止です。
Taq見たいな酵素もプロトコルの半量でやるような研究室なので、ピペッティングな無しでしたねえ。というかチューブに入った試薬から抜くときはほとんどピペッティングはしません。
PCR溶液に混ぜるときは、人それぞれですね。ピペッティングする人もいれば、入れてからチビタンで混ぜる人もいました。あと溶液はTaqを入れる前に残り全部を混ぜて、Taqを入れた後はピペッティングをしないでチップの先で混ぜるだけにする、見たいな意見もあります。

わたしは特にピペッティングをせずに試薬を混ぜて、指ではじいて混ぜてからチビタンでまとめ、Taqをピペッティング無しで添加して、終わり。と言うやり方を取っています。と言うか最後まで通してピペッティングゼロですね。
試薬を吸うときにピペッティングをするのはCTABやグリセロール系の試薬を吸うときくらいですね。

長々と書きましたが、まあまとめればPCRの試薬なら、プロトコルではロスをなくすためにピペッティングをするべき、と書かれていますが、実際の所は、ピペッティングは無しのほうがいいと思いますよ。と言うことです。

回答No.2

nonnon1190

質問者様はピペッティングという言葉をどういう意味で使われているのでしょうか？

ピペットを使って溶液を吸って他のチューブに入れることでしょうか？
それとも
ピペットで吸って出して吸って出してを繰り返すことでしょうか？

よくわかりません。

回答No.1

MIYD

dNTPs溶液が数百uL入っているチューブを10uL位で数回ピペッティングしようとしているのでしょうか？
ピペッティングする目的は何ですか？
混ぜるには量が少なすぎますし、ピペッティングしないことで実験に影響が生じるほどチップ表面にdNTPs溶液が吸着するようであれば、チップを替えるべきです。
逆にポリメラーゼ溶液のように粘性が高い溶液の場合、ピペッティング時に壁面に残り、安定した量を測り取ることが出来ません。

ということで、dNTPs溶液であれば、別にピペッティングしても致命的な問題が生じることはまず無いので、操作自体は何も実験にメリットをもたらさないでしょうが、「ピペッティングしてはならない」ということはありません。
ただ、溶液によってピペッティングしてはならない場合がありますので、判断できないのであれば、全てピペッティングしないで置くというのは一つのやり方です。

>そしてPCRチューブに移してPCR溶液の中でさらにピペッティングして出し切る
吸い取った溶液を出すときにピペッティングして壁面についた残渣を洗い流すことはメリットがあります。
ただ、dNTPs溶液を操作する際に、そのような残渣が実験に影響を与えるほど生じないチップを使うことをお勧めします。
上述のポリメラーゼ溶液であれば,ピペッティングをしなければ、安定した量は測り取れないと思います。

分子生物学の範囲内で言えば、吸い取る前にピペッティングをするメリットがあるのは、
有機溶剤を吸い上げる際に、チップ、ピペットマン内を飽和させる時くらいだと思います。