PCR法の成功率up

質問

卒業研究でPCRを行っています。
しかし、なかなか、思うように増幅できず、悩んでいます。
最近はプライマーダイマーばかり増幅されてしまします。
アニーリング温度やtempreteの量を変更したりと一応工夫はしていますが。。
100サンプルをPCRかけて、ひどいときは全滅という時すらあります。
今ある試薬とプライマーを使って、できる改善方法は何かありますでしょうか!?
それとも、新しいプライマーを設計した方がいいのでしょうか!?
ちなみに、プライマーのTｍ値　formerd:61.3、reverse:68.1
　　　　　PCR反応液の組成　TaKaRa Ex Taq 0.25μl、Taq buffer 5μl、dNTPとMgCl2 4μl、temperate 3μlにup to 50μl

回答No.4

noname#44724

hot startも試してみましたか？
ゲノムからだと、F-primerの温度が低いかも？？
また、primerの長さはどのくらいでしょう？
知人に恐ろしく長いprimerでTm値も高すぎ？って思われるような物を常に設計している方がいました。それで上手くいってました。
まぁ、そんな人もいるよって程度で聞き流してください。
ただ、hot startは効果あります。

また、サンプルは物によっては凍結融解を繰り返したらダメになるものもあるような？？
体を壊さない程度に頑張ってください。

条件を設定してから、サンプル数を増やしたほうがいいですよ。
試薬的にも、労力的にも。
ちなみに私のところは「こういう場合はこのキットを使う」というのがありました。
増やしたい所の情報を持っているのなら、もう一度現在ご使用のキットの説明書きと照らし合わせてみることもお勧めします。

補足

ご回答ありがとうございます。

primerの長さはF:20bps、R:21bpsです。
長さは特に問題はないと思いますが。。。
ただ、今更ですが、primerはシグマジェネシスから購入していますが、
シグマジェネシスの計算値のTm値と参考書のTm値がかなり異なります。
アリーニング温度について検討する余地がありそうです。

ご指摘いただいた通り、hot start法も試してみます。

回答No.3

noname#49779

プライマーを作り直すのもそうですが、
試薬を変えてみるのもいいと思います。
私は以前、タカラのExTaqを使用していたのですが、
どうもうまく行かなくて他のに変えた経験があります。
CGリッチな領域を増幅しているのであれば、DMSOやbetaine、牛アルブミンを添加すると良い結果が得られることがあります。
100サンプルもPCRをかける前に、きちんとバンドが出る
ことを確認した方が精神衛生上、良いですよ

お礼

ご回答いただいたのにお礼が遅くなり、申し訳ありません。
ありがとうございます。

そろそろ新しい試薬を購入しようと考えていたところなので、
他の試薬の購入も検討してみます。
スペーサー領域を増幅させているので、同種内でも変異が大きく、シーケンスしてみないとCGの含有量は分かりません。DMSOやbetaine、牛アルブミンの添加も試してみます。

回答No.2

Dr_Hyper

最初にかからなかったのに、そのうちかかるようになったということから、primer dimerに対して100% muchのprimerなどではないでしょうから、templateが非常に少ないことなどが原因かもしれません。または、templateを入れる前に、primerと酵素を入れている時間が非常に長い場合、そこで十分なモル数のprimer dimer用のtemplateが形成され、非常に少ないモル数の本来のtemplateがかかりにくくなっている可能性も無いとはいえません。これらの増幅をなくすには合成をし直すのがはやいですが、4年生の学生さんに私がアドバイスするとしたら、primerの濃度を低下させることと、primer mixの調整をし直す。サンプル数を減らして手早くPCRをかけてみて違いを比較するなど、すこし条件も気にかけますね。ドクターの学生にはそうゆうことを言ってる間に合成してやり直せ！ですが、失敗にはいろんなトラブルシューティングをする機会を内包していますので、一度ためしてみても良いかもしれません。実際にprotocol集のなかにはprimer mixやその凍結融解を嫌う物や、primer濃度に気をつかっている物があります。実際に、そのprimerしか設計できないようなPCRに遭遇したときに、対処できるようになるかの良い経験でもありますね。
「今ある試薬とプライマーを使って、できる改善方法は何かありますでしょうか!?」についてのお答えとして、こんなところになります。

補足

ご回答ありがとうございます。

最近はサンプル数を減らしてPCRをかけ、比較検討に力を入れています。
primerやtemplateの量を変えて、いろいろ試してみます。

ただ、12月に入っても結果が出ず、時間的制約がありますが、できる限りはやってみようと思います。

回答No.1

tunertune

プライマーダイマーができるのなら新しく設計したほうがいいと思います。
むしろプライマーダイマーができるような設計を何故したのかが疑問です。
注文したら早くて次の日に届くでしょうし、最近はプライマーの値段が安いので、どんどん作っちゃいましょう。

お礼

やっぱり、そうですよね。
実は、新しいプライマー設計した方がいいと後押ししてもらいたかったんです。ありがとうございます。

でも、最初の方はプライマーダイマーができなかったことが気にかかります。