電気泳動

質問

卒研で電気泳動を使っています。
グラディエント（濃度勾配）ゲルを作っているのですがゲルがうまくできません。特にゲルの底部が固まらないのです。薬品はすべて新しいものです。
去年作っていたときはちゃんとできていたのですが、今年になってから失敗ばかりしています。去年と作り方は何も変わっていないのですが・・・
何が原因だと考えられますか？

回答No.6

fujishiro

30ｍｌとはゲルの液量です。
私のとこで使ってる普通のゲル（水、Tris-base、アクリルアミド）の液量が30ｍｌだったもので。ちなみに厚さ１ｍｍです。

脱気はわたしもしてます。
しなくても確かに大丈夫なようですが。

あと、固めるときの空気のカットはどうしてますか？
水を重層してますか？わたしはブタノールですが。なかには重層しないで上をサランラップで包む人もいたけど…。

お礼

ありがとうございます。
今ゲル作ってきましたが、固まったのですが蒸留水との境界線とゲルの底の部分のラインがまがってます。これはAPSの濃度が多いのかなと思ってるんですが固まらないよりはいいのでそのまま続けていこうと思ってます。
今年になってから特にこの蒸留水との境界線がゆがんでます。本来ならまっすぐになりますよね。水を入れたときはまっすぐラインがあらわれるんですが、固まるとゆがんでるんです。
空気のカットは蒸留水です。

回答No.5

Grace-Wonder

脱気するとうまくいくことが多いですよ。温度が低くなると溶存気体の量が増えて、重合が阻害されることもあります。吸引ビンにTEMEDを入れる前の溶液を入れて、真空ポンプで引き、気泡が出なくなるまで脱気します。
　簡便には、ディスポののフィルター付ろ過システムでも、結構効果ありますよ。これだと未溶解のAPSも除けます。

お礼

脱気ですか。以前SDS-PAGEやったときに脱気やってたんですけど「やらなくてもあまり効果ない」って本に書いてあったのでそれ以来やってないです。
今回やってみようと思います。うまくいくかどうか・・・ありがとうございます！

回答No.4

fujishiro

10%APS溶液を３０ｍｌに対し、およそ100μlぐらい入れます。
10～20回分ぐらい作ったら？冷蔵庫で2週間から一ヶ月ぐらいならなんとか持つから。
ゲルを何回も作ったりするよりはよほど効率的で安価かと。

どーでもいいけどゲル版厚いなぁ。２ｍｍもあんの？グラディエントでは普通なのかなぁ。

卒論は…必ずしも自分がやったことだけではないよ。４年生は誰かに教えてもらったり，協力してやるものだから…。まー教授次第だが。

では、がんばってねー。

お礼

「10%APS溶液を３０ｍｌに対し、およそ100μlぐらい入れます」
３０ｍｌとは何の量なのでしょうか。
ガラス板は２組しかないのでそれを交替しながらやるしかないんです。
今週またがんばります！
ありがとうございます

回答No.3

fujishiro

APSは市販の溶液を買ってるんですか？
あまりゲルを使わないのならそれでも良いかもしれないけど(逆に大量に使うから新鮮なうちに使い切ると言うのでも問題はないけど。）、粉末を買って一週間以内に使いきる方がいいですよ。昔、他大学から来た人は毎回、粉末から作ってたらしく、大丈夫なの？と聞かれたぐらいです。それから量はきちんと記録にとって、30～60分ぐらいで固まる量を入れた方が良いですよ。

あ、あとゴムがぬれてる、っていうのはエタノールでぬれてないかってことだから、基本的に＃２さんと同じことを心配してるわけね。エタノールは多分、あなたの方法でも十分流れてる可能生が高いけど、わたしは30分ほど乾かします。水を入れて漏れを確認って言うのは…わたしは漏れないことを前提に組んでるもんで、確認しません。水とエタノールが混ざって飛びにくくなるって聞いたので。研究室仲間にはエタノールを入れて確認する豪快なやつもいますが…。エタノールが完全に飛びきっていないとゴム付近がごくまれに固まってないことがあります。

ムラができるって言うのは…ひょっとして逆にAPSとTEMEDが濃ゆ過ぎるのでは？とうたっがってみたりして…。

あとゲルの大きさってどれぐらい？あたりまえだけどでかいと固まりにくいしね。

お礼

ＡＰＳは粉末を使ってます。なので少々って加減がわからないんですよー
ゲル板の大きさは170mmの190mmでゲルの厚さが2mmです。
1月中に実験終わらないと論文も書けないので結局結果が出ないまま失敗になりそうです。そうゆうときの論文の結果ってなんて書けばいいんでしょう？？夏からずっとやってたのにこのままでは無念です～～

回答No.2

nitscape

#1さんの言うとおり試薬の新鮮さが大切です。

あとはAPSとTEMEDをいつもより多く入れるといいですね。
裏技はアクリルアミドを暖めるです。グラディエントであたためすぎるとむらができてヤバイと思いますが、普通のゲルを作るときはレンジでちょっとあたためるとすぐに固まります（暖めすぎると混ぜてる間に固まります）。

あ、ガラス板を洗うときのエタノール。これが残っていると固まりません。

お礼

ＴＥＭＥＤの量は決まってるのですがＡＰＳの量が「少々」としか書いてないのでいまいちどれだけ入れたらいいのかわかりません。少ないと固まらないし多いとゲル板に入れる前に固まったりしますよね。
アクリルアミドを暖めるのは気がつきませんでした。あっでもゲルの溶液を全部混ぜたあと暖かいお湯にビーカーをちょっと浸して暖めてましたけど、どうなんでしょう。
ムラができるのはあたためすぎなんですか。あたためすぎってのはどれくらいの温度でしょうか？？外に出しておいてもムラができるときがあるんですけど。
エタノールはガラス板を組み立てたあと蒸留水を入れて、漏れないか確かめるときエタノールって流れませんか？？

回答No.1

fujishiro

グラデイエントゲルは手作りしたことはないのですが…(出来合いのものしか使ったことがない。）ふつーのゲルしか作ったことがないことは最初に言い分けさせてね。

ときどき下級生をみてゲルつくりが下手な人はたいていよく混ぜてないです。APSとTEMEDとか。APSはなるべく新しいものではないとね。（あ、試薬は全部新しいのね！？ってゆーか新しい試薬はそもそも全部正しい組成ですか？昔、APSを下級生に作らせて、そのあとしばらくなんでかたまらね－んだとか言ってた経験あり。)あと、どうやってるのか底にあわがたまってる時がありますね。あとは低部を支えるゴムがぬれてるとか

それから…寒さが原因なのでは？寒いと固まるのが遅いです。今年に入ってから急に寒くなった地域もありますからね。それをきちんと見極めてからつまないときれいにつめないのでは？

お礼

ありがとうございます！！
ゲル溶液はよくまぜてると思うのですが・・・それに去年やったときはちゃんとできてたし。やっぱり温度って関係あるのですね。
ＡＰＳとＴＥＭＥＤはいつからのものかわかんないんですけど、それだけ唯一古いと思われるんです。私も「これが古いんじゃないですか？」っていっても教授のいいぶんは「それは関係ないんじゃない」って買ってくれないんです（涙）それにいままでは固まってたので・・・
寒さが原因なんでしょうか。それで最近はふらん機（３６度くらい）にいれてるんですけどやっぱり底のほうが固まりません。かたまっても底のほうにムラができてしまいます。