アガロースゲル電気泳動で

質問

ちわっす！
答え魔ぽんたくんでっす♪

今日は困ったコトがあって、投稿しました。
DNAマーカー（λ/HindIII）を1％アガロースゲルで電気泳動してるんだけど、DNAが高分子の部分でスメア状のバンドを作って上手く分離できません！！
(DNAがすべて、高分子エリアにスメア状バンドとして集まってしまいます)
（T_T）

泳動バッファなどの試薬は調製済みのメーカー製プレミックス品を使っているので、試薬の組成は合ってます。
希釈率にもミスはありませんでした。
この場合、どのような原因が考えられますか？

＜条件＞
・泳動バッファ（TAEバッファ）
・ゲル（1×TAEバッファでアガロースを溶解した1％ゲル）
・電圧＆時間（50ｖ,90分）
・DNA量（100ng,10ng,3ng,1ng,300pg）

回答No.3

geneticist12 · ベストアンサー

３つ可能性をあげます。

１．lambda HindIIIではなく、未消化のlambda DNAを間違えて流した。

２．長期間冷蔵保存されていて、付着末端が水素結合を起こしている。Lambda末端のcos siteでこういう事が起こるのはご存じだと思いますが、ふつうの制限酵素末端でも起こることがあります。→泳動前に50-60℃で3-5分処理。

３．泳動サンプルはちゃんとバッファーされていますか？
ローディング「バッファー」はバッファー成分を含んでいないのがふつうで、しかもBPBなどで酸性になっていたりします。
制限酵素消化液などはバッファーされているのでそのまま加えて問題ないですが、バッファーされていないDNAの水溶液に加えると、DNAが変性したり移動度が変わるなど、おかしなことになります。泳動サンプルの希釈にはTEなどを使いましょう。

お礼

そういえば、乱暴にアプライしてもサンプルが溢れなかったような・・・・・
geneticist12さんの言うとおり、BPBが多すぎて酸性になってたのかも！
geneticist12さん、ありがとね！
(*^_^*)
BPBの量を減らして再トライしてみるよ。

回答No.2

MIYD

何で検出しているのかわかりませんが、
EtBrでの検出でしたら、

λHindIIIトータルで10ng,3ng,1ng,300pgはバンドとして見ることができないのではないでしょうか。
スメア状になっているとしても3ngでぎりぎり、1ng以下は検出できないと思います。
もしどれのレーンも同じくらいのスメア状バンドとして見られているのならば、それはDNAではなくて何らかのごみだと思います。

ゲルが古いかアガロースの品質が悪いためにDNAが分離できていないのではないでしょうか。

ゲルが出来たてでないのでしたら、ウェルをよくピペッティングしてごみを除かないと同じような状態になることがあります。

もしくは間違えてアガーを使っていませんか？

お礼

えっ！？
ゴミでおかしくなることって、けっこう多いの？
ちょっと心配だからピペッティングしてからやってみるね。

回答No.1

overthisgraysky

スメア状、というのは、ＤＮＡのバンドの強弱なくもやもやになっている状態ですか？
それともＤＮＡのバンド同士がくっついていてうまく分離できないだけでしょうか？
後者でしたら、もっと薄いゲル（0.8％くらい）を使うか、長めのゲルで長時間泳動すればいいと思います。

お礼

アドバイスありがと！
濃度が違うかもしれないから、もう一度確認してみるね。