- 締切済み
FLP/FRT（もしくは Cre/Loxp）に替わるシステム
分子生物学の研究に関する質問です。 プロモーターA（-FLP）が働く状況でのみ、プロモーターBによって誘導されるタンパクXが作られるというようなシステムを考えています。 現在は以下２つのコンストラクトを作製しています。 1.promotorA-FLP 2.promotorB-FRT-GFP-pA(stop)-FRT-proteinX(=HSTK) Aが発現すればFLPタンパクが作られてGFP-ｐAの両端にあるFRTをcleaveし、結果として（GFPの代わりに）HSTKが発現され細胞がアポトーシスを起こすというものです。 ある事情により、全体の配列を出来る限り短くする、もしくはこのシステム自体を考え直さなければなりません。 少しでも配列を短くするため、GFP-pAの代わりにストップカセット（ストップフラグメント）を挿入することも考えましたが、論文を読む限りこれだけでも約1.3kbpあるので、現在のコンストラクトとほぼ変わりません。 どなたか、問題を解決できるようなアイディア等をお持ちではないでしょうか。どうぞよろしくお願い致します。
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
みんなの回答
- MIYD
- ベストアンサー率44% (405/905)
関連するQ&A
- 組換え遺伝子
組換え遺伝子って、目的のタンパク質をコードする遺伝子に、プロモータやエンハンサーをくっつけてるんですよね？ で、その種類なんですけど、アデノウイルス由来とか、サイトメガロウイルス由来とか、いろいろありますよね？ 種類によってどんな働きをするのでしょうか？ 遺伝子にはほとんんど無知なのですが、使わなくてはいけなくなりました。 ヒトCMV-IEプロモーター／エンハンサー下流に変異させたGFPをコードするシークエンスを配置したプラスミドで、GFPの上流にあるNhe(1)サイトでのみGFPとの融合タンパク質ができます。動物細胞中でのGFP高発現に用いられます。 ↑こんな説明を理解するためには、どう勉強したら良いのでしょうか？ 参考書の紹介でも構いません。 ご教授下さい！
- ベストアンサー
- 生物学
- タンパク質の発現について…。
久しぶりに質問させていただきます。融合GFPを取り扱う実験を行っているのですが、融合GFPがコードされたプラスミドDNA(Aとします。)から融合GFP部位の塩基配列を他のプラスミドDNA(Bとします。)に組み込む実験を行っています。PCRによって、ベクターBに融合GFP部位の塩基配列の導入が確認出来たのですが、いざこのプラスミドDNAからタンパク質を発現させ、抽出すると、GFP発光が全く確認出来ませんでした。 ホストベクターの種類によって、発現が抑制されるような事ってありますか？また、ライゲーションのやり方によって、3文字の認識コドンがずれる事とかあるのでしょうか？ ちなみに、このクローニングでは、タカラバイオ様のIn_fusion酵素を用いています。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- GFP遺伝子を含むプラスミドを大腸菌へ形質転換
GFP遺伝子をプラスミドpUC119に組込み、そのGFPを含んだプラスミドを大腸菌へ形質転換する実験を行いました。このプラスミドは、GFPとpUC119をそれぞれEcoR1で切断し、ライゲーション反応させて作ったものです。 今回の実験でできた大腸菌のコロニーを紫外線にあてて観察しました。 GFPの蛍光と大腸菌のβ-ガラクトシダーゼ活性を利用した遺伝子工学実験の基礎です。 その実験結果でわからない問題があるのでこの場でみなさんのお力をお借りしたいと思い投稿させていただきました。 最終的にできたいくつかの大腸菌コロニーのなかで不思議なものができました。それは コロニーの色：薄い青（lacZが発現） 蛍光：あり（GFPを含む） というものです。なぜこうなってしまったのかがわかりません。 GFP断片を含むのにlacZが生成することなんてありえるのでしょうか？ 学生実験なのですが、ちなみに他の班も全員同じ結果となりました。 なので全員が実験操作を誤った確率は低いと思います。 この問題の参考資料として次のようなものが配布されました。 pUC119・lacZα-フラグメントの配列（塩基配列およびアミノ酸配列） あと 今回の実験で使ったGFPuv遺伝子断片のEcoR1切断領域の配列（塩基配列および3フレームで翻訳したアミノ酸配列） この2つがなんらかのヒントになっていると思うのですが、この資料でなにがわかるのかよくわかりません。 詳しい方、お教えください！
- ベストアンサー
- 生物学
- CREを用いたノックアウトマウスの作成
バクテリオファージのCREタンパクはloxpという塩基配列を認識して２つのloxpではさまれた塩基配列を切り出す。 よってloxp間の遺伝子(エクソン)はCREによって欠損させることが可能である。 では、ある疾患に対し膵臓の内分泌細胞に問題があり、これには遺伝子Bがかかわっていることが予測されている。 そこでこの遺伝子Bが膵臓の内分泌細胞においてどのような役割があるか調べることにした。 遺伝子Bの機能を膵臓のない分泌細胞だけにおいて欠損させたマウスを以上のことから作りたい。 どうすればいいか？説明せよ。 という問題がありました。 解答が １：B遺伝子をloxpで挟んだ遺伝子を作り、ホモ接合のマウスを得る。 ついで膵内分泌細胞で特異的に発現していると思われるプロモーター、エンハンサーの下流にCRE遺伝子をつないだDNAをマウス由来の受精卵に導入する。 ２： 1と同じ手法で膵内分泌細胞でのみCREを発現しているマウスを作成し、１のマウスと交配する というのが解答でした。 生物IIのノックアウトマウスの概念を呼んだことがあるだけで上記の答えをみると疑問が湧きました。 まず、１のステップではB遺伝子を切るためのアクションだというのはわかるのですがなぜCRE遺伝子をつないだものを受精卵に導入するのでしょうか。 受精卵に導入するだけでB遺伝子にloxpを挿入したように簡単にCREの機能を備えた遺伝子を受精卵に電気穿孔でいれるだけでCRE機能＋のマウスができてしまうのですか？ というかB遺伝子loxp(+)のホモを作成というステップ自体もそもそも受精卵にB遺伝子loxp(+)の遺伝子を受精卵に導入して作ったということなのでしょうか。 よく、ノックアウトマウスの説明をする際、超頻出文章で 「●●遺伝子のホモを作成」とありますがこのホモ接合体を作成＝受精卵への遺伝子導入 ということなのでしょうか。 そして問題なのは１のステップでは導入がうまくいけば B遺伝子を切り取るマウスが出来上がる はずですがなぜ ステップ２を行う必要があるのでしょうか。どうして１だけでは膵臓のみでCREを発現しているマウスが得られたといえないのでしょうか。 そしてステップ２を行うならば最初から 「膵臓の内分泌でのみCREを発現する遺伝子操作をおこなったCRE結合遺伝子を受精卵に導入する」 ということで済むはずだと考えたのですがなぜそれでは駄目でわざわざ別々の方向からCREの制御をしているのでしょうか。 このままだと交配してホモを作成することも考えるとステップ１のCRE導入時にすでに膵内分泌特異的塩基配列の場所でCREをいれればいいのにと考えてしまいました。 長くなりましたが、時間はいつでもかまいませんので一つ一つ上記疑問点にお答えくださる方ご指導お願い申し上げます。
- ベストアンサー
- 生物学
- pSectag2B を用いたベクター構築と組み替え蛋白質を用いた抗体作成
現在pSectag2B発現ベクターを用いた組換え蛋白質の発現ベクターを構築しようとています。 (http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/V900-20_001.shtml) 現在プライマーの構築を行っている段階ですが、どの制限酵素サイトをつけるかを考えています。 ＭＣＳの中央のあたりでつなげなければ(たとえばpSectag2BでいえばBamHIとXhoIの組み合わせ)、 N末C末両端に余計なアミノ酸残基が引っ付いてきてしまうと思います。 また、Histagとのリンカー部位も入ってきてしまいますので、生理活性に影響が出ないか少々心配なところです。 ORFの上流はできる限りシグナル配列の直下につなげたほうが良いのでしょうか？ また、リンカー配列もできるだけ短くしたほうが生理活性に影響が出る可能性は少ないのでしょうか？ さらに、上記の方法で作成した組換え蛋白質(仮に蛋白質Aとしておきます)を抗原としてマウスモノクローナル抗体(中和抗体)を作成しようと考えています。 抗原がマウスのもつその蛋白質Ａとホモロジーが非常に高いため、リンカー配列などを認識してしまうのではないかと考えています。 ホモロジーの高い抗原を用いて抗体を作成するのはやはり難しいのでしょうか？ ラビットのポリクロ抗体でも作ったほうがいいのでしょうか？ 念のため類似した質問がないか確認はしましたが、重複していたらすみません。 色々とあつかましい質問ですが、よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- プロモーター解析
全くの素人です。遺伝子工学ハンドブックを購入しだいそちらも参考にしますが、今はまだないので教えていただければと思います。 レポーター遺伝子つきのベクターに調節領域を挿入して対象細胞での発現を見る方法は分かったのですが、その他の方法で混乱してしまいました。S1マッピングという方法がありますが、参考書の図を見ても理解できませんでした。これは、プロモーター領域を含む5'プローブでmRNAとハイブリダイズさせた後、S1で切ってハイブリダイズした部分だけを電気泳動しているようですが、プローブをDNA上の調節領域とmRNAコード配列の境界となるように設計して、電気泳動でのサイズからその部位（転写開始点やスプライス部位など）を調べるということで良いのでしょうか？この場合は当然転写調節の標的となるmRNAを用いると思いますが、レポーターアッセイの場合はこのmRNAがGFPやルシフェラーゼになっている訳ですよね？ また電気泳動でサイズが分かったら、標的調節領域に変異を導入して詳しい機能を調べるという手順でしょうか？ 実験せずに想像で書いていますので、誤りを指摘して下さると助かります。
- ベストアンサー
- 生物学
- ＦＬＰ食品について
こんにちわ！ ＦＬＰ食品について調べています。 産後太りをどうにかしようと調べていたら、 ＦＬＰ食品のアロエベラジュース、ビープロポリス、ビーポーレン、プロテインを飲んでいます。 本当にこれでやせれますか？ 結構お高いので、心配しながら飲んでいます。 知っている方教えてください。＾０＾ よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- その他（病気・怪我・身体の不調）
- CRE 250の燃費
こんばんは。 今度知人からＣＲＥ250というバイクを譲ってもらうのですが、そこで疑問に思ったのですがＣＲＥ250というバイクの街乗りと高速などの燃費ってどのくらいでしょうか？ というのも片道30キロの通勤に使おうと思いました燃料が足りるのか？と疑問に思ったもので質問させていただきました。通勤にはまるで不向きなバイクであるのは十分承知です。夜間走行はする気はございません。ですが参考にしたいのでご教授お願いします。
- ベストアンサー
- バイク・原付自転車
- FLPの会員について教えてください。
アロエベラジュースなどを知り合いに勧められて飲み始めました。 その知り合いからの紹介で会員になると３割引で購入出来るときき、講習会のようなものに参加しました。 その後、自分で購入するつもりでしたが、自宅に余っていたので、まだ購入していません。 知り合いには買った？と聞かれたので、面倒でつい「買った」と言いましたが、「本当に買った？いつ頃？おかしいなあ。」と言われました。 私が購入した場合は、紹介者には何か知らせや、何を買ったなど、購入履歴がわかるようになっているのでしょうか？ 紹介された人達の購入する本数が増えれば増えるほど、親となる紹介者の値引率が増え、副業にもなるとは聞きましたが、（私は自分の飲む分だけ安く飲めれば良いのですが。）購入履歴なども知られるのは、個人情報もあるし、いやだなと思いまして。 そのあたりのこと、教えていただければと思います。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- その他（健康・病気・怪我）
